电影《731》于9月18日全球同步上映，首日便创下多项票房纪录。根据网络平台实时数据显示，该片上映首日综合票房突破1.84亿元，成为中国影史单片单日票房冠军。在排片方面更创下惊人成绩，首日放映场次达26.4万场，一举打破内地影史首映日总场次、单片单日总场次等10项重要纪录。
这部时长125分钟的战争题材影片自9月18日上午9时起在全国公映。值得注意的是，多地影院特意将首场放映安排在9时18分，并在排片表上标注1"警钟长鸣1"的特殊标识。影院工作人员透露，这个时间点的安排具有特殊纪念意义。影片上映首日即包揽2025年9月战争片内地票房冠军、2025年第37周内地票房冠军等37项重要荣誉。
9月17日下午，影片在哈尔滨哈东万达影城IMAX GT影厅举行了盛大的全球首映礼。据数据显示，该片在9月18日上映前的预售票房就已突破1亿元，成为春节档之后首部预售破亿的影片。首映现场，导演赵林山难掩激动之情，在致辞时数度哽咽落泪。他动情地表示：1"当'731'三个字出现在大银幕上时，我的泪水就再也控制不住了。选择在哈尔滨举行首映，是对历史的一种告慰。1"
影片的震撼力在首映现场得到充分体现，沉重的情节令不少观众潸然泪下。首映结束后，首批观众反响热烈，有观众评价影片结局出人意料却尊重史实，更有人感慨这不仅仅是一部电影，更是一堂生动的历史教育课。
这部由黑龙江、山东、吉林等省委宣传部联合监制，长春电影集团、哈尔滨市演艺影视集团等共同出品的影片，选择在具有特殊历史意义的9月18日上映，旨在唤起人们对历史的记忆与反思。影片在中国大陆及澳大利亚、新西兰同步上映后，次日将在北美地区登陆各大影院。首映式上，主创团队与观众共同缅怀历史，呼吁铭记历史教训，珍视来之不易的和平。影片上映后获得观众广泛好评，不少网友自发表示支持这部具有深刻历史意义的作品。
