众多生物学实验都需要对目的蛋白进行固定和标记，如进行 SPR 和 BLI 时需要将蛋白固定在芯片或探头上，进行 MST 或者荧光显微镜观察时，需要给目的蛋白偶联上荧光基团或者将荧光蛋白与目的蛋白进行融合。但常规的氨基偶联对于蛋白的偶联没有特异性，可能会在偶联的过程中影响蛋白的活性。有一类蛋白标签，如 Avi Tag，能够进行定点标记。下面给大家介绍三种能够进行定点标记的蛋白标签。
1 Avi TagAvi Tag 是由15个氨基酸残基构成的短肽标签（GLNDIFEAQKIEWHE），拥有一个可生物素化的赖氨酸残基，在生物素连接酶（BirA）作用下，该赖氨酸能够特异性的共价连接上一个生物素分子。
图1 BirA 生物素化 Avi Tag 示意图
通过 Avi Tag 能够定点生物素化的特点，Avi Tag 具有广泛的用途，如作为亲和标签进行融合蛋白纯化、作为诱饵蛋白进行 pull-down 实验以及用于 BLI （生物膜干涉技术）等相互作用检测。
Avi Tag的优势1. 一致性的标记：生物素化发生在 Avi 标签的单个赖氨酸残基上，是定点标记，不会影响蛋白的活性。
2. 统一的蛋白方向：当与链霉亲和素包被的表面结合时，由于对生物素化的精确控制，使得 Avi 标签的蛋白方向一致性高，提高结合分析实验的效率。
案例分享：通过BLI验证携带Avi Tag的新冠病毒RBD区域与scFv（single‐chain variable fragment）的相互作用[1]上海中科院团队首先通过 ELISA 实验筛选与新冠病毒存在相互作用的 scFv，之后通过融合表达携带 Avi Tag 的新冠病毒 RBD 区域，通过将 RBD 蛋白生物素化，使用 BLI 实验验证了 RBD 与 scFv 的相互作用。
图2 BLI 验证 RBD-Avi tag 与 scFv 的相互作用
SNAP Tag 是一种来源于O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶（AGT）的小型工程化蛋白，由182个氨基酸组成（20KD），能够通过酶促反应将底物（如修饰的苄基鸟嘌呤，benzylguanine，BG）上的标记基团共价连接到其活性位点的半胱氨酸残基（Cys145），从而实现目标蛋白的特异性标记。
SNAP Tag 可广泛用于目标蛋白的亚细胞定位、蛋白纯化以及固定后的蛋白与蛋白间相互作用研究等。
图3 SNAP Tag 标记目标蛋白示意图
图4 SNAP Tag 可用于多种生物学研究
大连理工肖义教授团队利用近红外荧光团开发了 SNAP-tag 探针 PYBG-D，该探针拥有良好的透膜性，能够特异性地标记融合了 SNAP 标签的组蛋白2B，并进行显微镜观察。
图5 通过 SNAP Tag 观察组蛋白亚细胞定位
HaloTag 是基于脱卤素酶的融合蛋白标签，由293个氨基酸（33KD）组成，能够与特定的底物（卤代烷烃）进行高效的化学反应，使自身106位的天冬氨酸与脱去卤原子的底物形成稳定的共价标记物，从而实现目标蛋白特异性标记（图6）。
基于不同的卤代烷烃衍生物，Halo Tag 可用于不同的生物学研究，如用于细胞成像，蛋白相互作用检测，蛋白纯化等（图7）。
图6 Halo Tag 与卤代烷烃反应示意图（以荧光基团标记的卤代烷烃为例）
图7 Halo Tag 可与不同卤代烷烃反应达到不同用途
华中科技大学张玉慧教授课题组与合作团队武汉血液中心马严课题组设计并制备了一种新型表面功能化 Halo-tag 金纳米荧光探针（GNP-Atto565-fR8-CA），并且将内质网定位蛋白 Sec61β 与 Halo Tag 融合。通过 Halo Tag 与卤代烷烃的共价结合，定点给内质网标记荧光信号，成功观察到内质网长期的动态过程。
图8 基于 Halo Tag 观察内质网长期动态过程
1. Li T, Cai H, Zhao Y, et al. Uncovering a conserved vulnerability site in SARS-CoV-2 by a human antibody. EMBO Mol Med. 2025;13(12):e14544. doi:10.15252/emmm.202114544
2. Reja SI, Minoshima M, Hori Y, Kikuchi K. Near-infrared fluorescent probes: a next-generation tool for protein-labeling applications. Chem Sci. 2025;12(10):3437-3447. Published 2025 Oct 23. doi:10.1039/d0sc04792a
3. Song X, Bian H, Wang C, Hu M, Li N, Xiao Y. Development and applications of a near-infrared dye-benzylguanine conjugate to specifically label SNAP-tagged proteins. Org Biomol Chem. 2017;15(38):8091-8101. doi:10.1039/c7ob01698k
4. Xu P, Zhong S, Wei Y, Duan X, Zhang M, Shen W, Ma Y, Zhang YH. Surface-Functionalized Halo-Tag Gold Nanoprobes for Live-Cell Long-Term Super-Resolution Imaging of Endoplasmic Reticulum Dynamics. ACS Nano. 2024 Aug 13;18(32):21433-21446. doi: 10.1021/acsnano.4c06138. Epub 2024 Jul 30. PMID: 39080511. doi:10.1021/jacs.0c00451
