第一步，筛选CARM1的互作蛋白
通过anti-Flag-CARM1 IP-MS鉴定与CARM1相互作用的蛋白，分析显示CARM1与HIF1A存在关联（图1a）。
第二步，验证CARM1与HIF1A相互作用
在常氧和缺氧条件下，进行Co-IP分析，CARM1和HIF1A相互作用（图1b-e）。此外，GST pulldown实验也证实CARM1与HIF1A互作（图1f-g）。
第三步，确定CARM1与HIF1A互作具体位置
构建截短载体GST-CARM1-EVH1结构域（1-140 aa）、GST-CARM1-cat（141-480 aa）和GST-CARM1-c（481-608 aa），进行GST pulldown实验，表明CARM1的EVH1结构域负责与HIF1A相互作用（图1h-j）。此外，构建突变体进行GST pulldown实验，CARM1-∆EVH1（141-608 aa）不能与HIF1A相互作用，甲基转移酶失活的CARM1-R168A突变体不影响CARM1与HIF1A的相互作用（图1k），即这种相互作用不是一种翻译后修饰（PTM）的方式。
同样，构建GST-HIF1A bHLH结构域（1-80 aa）、GST-HIF1A-PAS （81-350 aa）、GST-HIF1A-ODD （351-600 aa）和GST-HIF1A-TAD（601-826 aa）进行GST pulldown实验，显示HIF1A的TAD结构域负责与CARM1相互作用（图1l-m）。
第四步，CARM1与HIF1A互作结合CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的启动子，调控其表达
用含缺氧反应元件（HREs）的pGL4.42载体转染细胞，检测常氧和缺氧条件下荧光素酶的活性（图1n），发现CARM1直接调控缺氧信号通路。BIOBASE分析显示CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的启动子都具有潜在的HIF-1结合序列（图1o）。表明，CARM1直接与HIF1A相互作用，并调节其表达。
全文分享：《Protein Cell》解读：CARM1与HIF1A互作结合至多个靶点启动子，协调促进三阴性乳腺癌（TNBC）的进展。
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