Cas是CRISPR相关蛋白的简称，簇状规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）和相关蛋白（Cas）构成CRISPR–Cas系统；该系统分为3大类，且有许多种类的Cas蛋白，第2类CRISPR-Cas系统是由单一、大、多结构域的蛋白质组成复合体发挥作用，一些2类效应蛋白，如Cas9,已经成功地用于基因组工程。
在设计gRNA的时候如何选择Cas9蛋白，可以综合考虑以下关键因：
1.目标序列的PAM（原间隔相邻基序）
Cas9的只有当DNA🧬靶位点附近存在PAM时，才能进行准确切割。PAM的存在也是激活酶Cas9所必需的，不同Cas9蛋白识别不同的PAM序列，可需根据目标位点附近的可用PAM选择对应的Cas9：
①SpCas9（最常用）：PAM为NGG（或较弱的NAG）；
②SaCas9：PAM为NNGRRT（更复杂，但体积更小，适合AAV递送）；
③xCas9或SpCas9变体（如SpG、SpRY）：可识别更广谱的PAM（如NG、GAA等）；
④其他同源物：如St1Cas9（NNAGAAW）、NmCas9（NNNNGATT）等；
2.蛋白尺寸与递送方式
常用的有SpCas9，尺寸比较大，会受到病毒载体限制（如AAV容量~4.7kb），这时候可能需要更小的Cas9变体：如SaCas9（编码序列大小为3.2kb）或超小型Cas9 Mini（编码序列大小为2.7kb）。
也可尝试非病毒递送，如质粒、RNP复合体等方法，则无需考虑蛋白尺寸，可使用SpCas9或其他大体积高活性变体。
3.特异性需求
基因组极为复杂，gRNA可能与非靶向序列局部匹配，这种局部匹配也会激活Cas 9内切酶活性，从而产生脱靶效应。脱靶可能影响正常基因的功能表达，甚至激活致癌因子、抑制抑癌基因，造成安全隐患，这极大的阻碍了该技术在临床的进一步应用。
为了减少脱靶，可选择一些高保真变体如通过突变降低脱靶活性的SpCas9-HF1、eSpCas9、HypaCas9等；
传统的Cas9蛋白包含RuvC和HNH两个催化结构，RuvC和HNH可分别剪切DNA🧬的两条链形成双链断裂，采用CRISPR/Cas9n系统（如Cas9 D10A变体),仅在一条链上产生单链切口（Single-strand break, SSB），有效降低脱靶活性。
4.应用场景
对于基因敲除（KO），可选择标准SpCas9或高活性变体（如SpCas9-VRQR）；若需进行碱基编辑（Base Editing），需匹配对应的dCas9-脱氨酶融合蛋白（如BE4max）。
对于基因激活/抑制（CRISPRa/i），可选择选择催化失活型的dCas9并融合转录效应子（如dCas9-VP64）；
如果要先导编辑（Prime Editing），需使用逆转录酶融合的Cas9（如PE2）；
5.细胞类型与物种兼容性
哺乳动物细胞选择SpCas9、SaCas9、HiFi Cas9等常用；植物或微生物可能需要优化密码子或选择特定同源物（如FnCas9）；针对原代细胞或难转染细胞：推荐RNP递送（Cas9蛋白+gRNA复合体），减少毒性并提高效率。
6.特殊功能需求
温度敏感型Cas9（如tsaCas9）可在特定温度下激活/失活，运用于时空控制编辑；光控Cas9（如Light-inducible Cas9）能通过光信号调控活性；多基因编辑时可采用正交Cas9系统，组合不同Cas9（如SpCas9+SaCas9）避免gRNA交叉干扰。
