类器官（Organoid）作为生命科学和医学研究领域的“明星模型”，在疾病机制解析、药物筛选、个性化医疗等领域展现了革命性的潜力。然而，许多科研人员在尝试类器官培养时，常常面临“无法形成三维结构”“细胞活性低下”“传代失败”等棘手问题。究其根源，培养体系中细胞因子的选择与配比往往是决定成败的核心因素。
本文将以经典培养方案WENR（Wnt3a、EGF、Noggin、R-Spondins）为核心，深入解析其四大关键因子的协同作用机制，并结合实际应用场景提供优化建议，助力科研人员攻克类器官培养的技术壁垒。
一、WENR方案的起源与核心价值
WENR方案由“类器官之父”、荷兰Hubrecht研究所的Hans Clevers教授团队于2010年首次提出，其名称源于四大核心成分：Wnt-3a、EGF、Noggin和R-Spondins。这一方案通过精准模拟体内干细胞微环境的信号通路动态平衡，成功实现了肠、胃、肝等多种类器官的长期稳定培养。
△ Hans Clevers教授
干细胞微环境的仿生设计
在肠道、肝脏、胰腺等器官的干细胞生态位中,Wnt信号通路、EGF信号通路和BMP信号通路的相互作用是维持干细胞自我更新与分化的关键。WENR方案通过以下策略模拟这一微环境：
- 激活增殖信号：Wnt-3a与R-Spondins协同激活Wnt通路，驱动干细胞分裂。
- 抑制分化信号：Noggin通过阻断BMP通路，延缓干细胞过早分化。
- 促进存活与扩张：EGF通过MAPK/ERK通路增强细胞增殖能力。
目前，WENR方案已成功应用于胃、小肠、结肠、肝脏、胰腺、肺等多种类器官的培养，并衍生出针对不同组织的优化版本（例如添加FGF10用于肺类器官）。
△ Wnt信号通路
二. WENR“四大护法”的分子机制与功能解析
Wnt-3a：干细胞增殖的“发动机”
Wnt-3a是经典Wnt通路的核心激活剂。其通过与细胞膜上的Frizzled受体结合，稳定β-catenin蛋白，进而启动下游靶基因（如c-Myc、Cyclin D1），调控细胞周期进程。
- 关键作用：
1. 维持干细胞干性：缺乏Wnt-3a时，肠类器官在培养3天后即停止增殖并解体[1]。
2. 驱动三维结构形成：在小鼠结肠类器官中，Wnt-3a的添加是隐窝-绒毛结构形成的前提条件。
3. 浓度优化：浓度过高会导致类器官结构紊乱（如过度囊性化），推荐使用50-100 ng/mL，并根据组织类型动态调整[2]。
EGF：细胞增殖的“加速器”
表皮生长因子（EGF）通过与EGFR受体结合,激活MAPK/ERK信号通路，促进细胞增殖与存活。
- 功能特点：
- 增强类器官体积：在胃肠道类器官中，EGF可显著增加集落大小[3]。
- 非必需但增效：虽然部分类器官（如肝脏）可在无EGF条件下生长，但其存在可提升培养效率。
- 使用建议：
- 推荐浓度为50 ng/mL，需定期更换培养基以避免异常分化（如肿瘤类器官需调整浓度）。
- 由于EGF易被蛋白酶降解，建议使用无血清培养基。
Noggin：抑制分化的“守门员”
Noggin是一种内源性BMP抑制剂，通过阻断BMP与受体结合，抑制干细胞的分化倾向，从而维持其未分化状态。
- 核心作用：
- 平衡信号通路：在肺类器官中，Noggin缺失会导致肺泡上皮细胞过早分化[4]。
- 支持长期传代：肝类器官的持续扩增依赖于Noggin与Wnt-3a的协同作用。
- 注意事项：
BMP信号过度激活会诱导类器官形成非功能性囊状结构，需严格控制Noggin浓度。
R-Spondins：Wnt信号的“放大器”
R-Spondin（RSPO）家族包含四个亚型（RSPO1-4），其通过与LGR5受体结合，增强Wnt信号的强度和持续时间。
- 实验证据：
- 缺乏RSPO时，肠类器官在4-5天后停止生长[5]。
- 低浓度（1.2%）RSPO会导致类器官破裂，而10%-25%浓度可实现稳定生长。
- 应用策略：
- 需根据组织来源选择特异性亚型（如RSPO1常用于肠道类器官）。
- 与Wnt-3a协同使用效果更佳，单独使用效果有限。
三、WENR方案的优化与实操技巧
浓度调控与动态调整
1. Wnt-3a与R-Spondin：两者需协同使用，但需避免过度激活。建议在培养后期逐步降低Wnt-3a浓度以诱导分化。
2. EGF：长期高浓度可能诱导癌细胞异常增殖，需根据类器官类型调整（如肠癌类器官需降低浓度）。
培养基与保存条件
1. 无血清培养基：减少蛋白酶对EGF的降解，同时降低批次差异。
2. 分装保存：Wnt-3a和R-Spondin易失活，建议分装后-80℃保存，避免反复冻融。
组织特异性调整策略
1. 胃类器官：需额外添加FGF10以促进胃腺结构形成。
2. 肺类器官：联合使用BMP抑制剂（Noggin）和FGF10可模拟肺泡发育微环境。
3. 肿瘤类器官：需根据癌细胞特性调整生长因子配比（如降低EGF浓度以抑制过度增殖）。
四、WENR方案的应用案例与未来展望
成功案例解析
1. 肠道类器官：通过WENR方案培养的LGR5+干细胞可形成隐窝-绒毛结构，用于研究克罗恩病和结肠癌[6]。
2. 肝类器官：在添加HGF和FGF19后，可实现肝细胞功能的长期维持，用于药物肝毒性测试[7]。
技术挑战与改进方向
1. 血管化问题：现有类器官缺乏血管网络，未来可通过共培养内皮细胞解决
2. 高通量筛选：开发标准化培养流程以适配自动化药物筛选平台。
△ 血管化脑类器官[8]
总结:
WENR 方案的成功印证了 "少即是多" 的哲学理念。未来随着单细胞多组学技术的发展，我们有望实现类器官培养的精准调控。建议研究者建立 "因子-表型" 响应矩阵，结合生物信息学分析优化培养体系。对于产业化应用，开发无动物源成分的培养基将是突破点之一。
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参考文献
[1] Barker N, Huch M, Kujala P, van de Wetering M, Snippert HJ, van Es JH, Sato T, Stange DE, Begthel H, van den Born M, Danenberg E, van den Brink S, Korving J, Abo A, Peters PJ, Wright N, Poulsom R, Clevers H. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 2010 Jan 8;6(1):25-36.
[2] Merenda A, Fenderico N, Maurice MM. Wnt Signaling in 3D: Recent Advances in the Applications of Intestinal Organoids. Trends Cell Biol. 2025 Jan;30(1):60-73.
[3] Zhang Y, Huang S, Zhong W, Chen W, Yao B, Wang X. 3D organoids derived from the small intestine: An emerging tool for drug transport research. Acta Pharm Sin B. 2025 Jul;11(7):1697-1707.
[4] Chung MI, Bujnis M, Barkauskas CE, Kobayashi Y, Hogan BLM. Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation. Development. 2018 May 11;145(9):dev163014. doi: 10.1242/dev.163014. Erratum in: Development. 2024 Aug 6;151(15):dev204253.
[5] Thalheim T, Quaas M, Herberg M, Braumann UD, Kerner C, Loeffler M, Aust G, Galle J. Linking stem cell function and growth pattern of intestinal organoids. Dev Biol. 2018 Jan 15;433(2):254-261.
[6] Sato T, Clevers H. SnapShot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 2015 Jun 18;161(7):1700-1700.e1.
[7] Bae J, Choi YS, Cho G, Jang SJ. The Patient-Derived Cancer Organoids: Promises and Challenges as Platforms for Cancer Discovery. Cancers (Basel). 2022 Apr 25;14(9):2144.
[8] Sun XY, Ju XC, Li Y, Zeng PM, Wu J, Zhou YY, Shen LB, Dong J, Chen YJ, Luo ZG. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 2022 May 4;11:e76707.
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