一、圆二色性 (CD) 在蛋白质研究中的重要性
蛋白质在生物过程中发挥着核心作用，其结构与功能直接相关。了解蛋白质结构对于研究疾病机制、药物开发和生物制药工程至关重要。圆二色性 (CD) 光谱 是一种强大的工具，它通过测量蛋白质对左圆偏振光和右圆偏振光的差异吸收来分析蛋白质结构。
圆二色谱（CD）光谱法 能够深入了解蛋白质的二级和三级结构，帮助科学家追踪蛋白质在各种条件下的折叠、稳定性和构象变化。这使得圆二色谱成为生物研究和药物开发中不可或缺的技术，并直接将蛋白质结构与功能联系起来。
二、FUV-CD 与 NUV-CD：主要区别
CD 光谱根据波长分为两个主要区域：
- 远紫外 CD （FUV-CD，180–250 nm）：分析蛋白质中的肽键，揭示二级结构，如α 螺旋、β 折叠和无规卷曲。
- 近紫外 CD (NUV-CD，250–320 nm)：关注芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）周围的环境，提供有关 蛋白质三级结构的信息。
FUV-CD 擅长检测二级结构组成，而 NUV-CD 则能够捕捉蛋白质折叠、配体结合和稳定性中细微的构象变化。两者相结合，为研究蛋白质结构提供了一种全面的方法。
三、远紫外圆二向色性（FUV-CD）：原理与应用
3.1）FUV-CD 的工作原理
远紫外圆二色性 (FUV-CD) 基于远紫外波段 (180–250 nm) 内肽键与圆偏振光之间的相互作用。由于蛋白质具有手性结构，它们对左旋和右旋圆偏振光的吸收方式不同，从而产生特征性的圆二色性光谱。
- α螺旋在208nm和222nm 处产生两个不同的负峰。
- β折叠在195nm 附近呈现正峰，在215nm 附近呈现负峰。
- 无规卷曲在200nm 附近呈现宽负峰。
通过分析这些光谱模式，研究人员可以估计蛋白质内不同二级结构的比例，追踪结构变化，并研究蛋白质折叠动力学。
3.2）测量 FUV-CD：实验装置
FUV-CD 测量需要 CD 光谱偏振仪，其包括：
- 稳定的紫外线光源
- 用于选择特定波长的单色仪
- 用于产生圆偏振光的偏振器和调制器
- 带有石英比色皿的样品室（光程通常为 0.1-1 厘米）
- 记录吸收差异的检测器
3.3）样品制备注意事项：
- 蛋白质浓度：0.1-1 mg/mL
- 溶剂选择：优先选择重水（D₂O），因为标准水在远紫外范围内吸收强烈
- pH 值和温度控制：确保测量期间的稳定性
实验过程中，记录180–250 nm范围内的CD光谱，捕捉蛋白质二级结构组成。
3.4）FUV-CD 的优点和局限性
优点：
- 一种快速灵敏检测蛋白质结构变化的方法
- 只需极少的样品制备，非常适合有限蛋白质量的测定
- 可以实时监测蛋白质折叠、稳定性和配体相互作用
限制：
- 远紫外波长处的强溶剂吸收需要仔细选择缓冲液（例如，用 D₂O 代替 H₂O）
- 无法提供原子分辨率的结构细节，需要补充技术（例如，X 射线晶体学或 NMR）
四、近紫外圆二色性（NUV-CD）：探测三级结构
4.1）NUV-CD 的工作原理
近紫外圆二色性光谱 在250至320纳米范围内工作，其中芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）和二硫键吸收圆偏振光。由此产生的光谱图谱反映了这些残基的微环境，有助于深入了解蛋白质的三级结构。
- 色氨酸残基 对构象变化高度敏感，使其成为蛋白质折叠的关键指标。
- 酪氨酸和苯丙氨酸 根据它们的氢键和溶剂暴露贡献额外的光谱特征。
- 二硫键 通过稳定蛋白质折叠模式来影响 CD 信号。
当蛋白质发生构象变化（例如配体结合、pH 变化或突变）时，其 NUV-CD 光谱会发生变化，从而揭示结构修饰。
4.2）NUV-CD 实验装置
NUV-CD 遵循与 FUV-CD 类似的方法，但操作波长更长。
设置上的主要区别：
- 由于 NUV-CD 信号较弱，蛋白质浓度通常较高（0.5-2 mg/mL） 。
- 溶剂吸收率较低，可使用标准水性缓冲液 代替 D₂O。
- 样品处理必须尽量减少外部发色团（例如辅因子、染料），以避免光谱干扰。
4.3）NUV-CD 的优势与局限性
优点：
- 直接检测三级结构稳定性和构象转变
- 与标准水性缓冲液兼容，降低实验复杂性
- 提供蛋白质折叠和药物-蛋白质相互作用的实时监测
限制：
- 与 FUV-CD 相比信号较弱，需要更高的蛋白质浓度
- 分辨率有限——如果没有辅助技术（例如荧光光谱或分子对接），就无法精确定位特定的原子级相互作用
五、蛋白质分析中远紫外和近紫外圆二色谱的比较
5.1）基本原理和测量方法
FUV-CD 和 NUV-CD 具有共同的光学原理，但在蛋白质研究中具有不同的分析目的。
这两种技术都依赖于光学活性蛋白质成分对左旋和右旋圆偏振光的差异吸收。然而，它们的光谱焦点不同：
- FUV-CD（180–250 nm）：主要检测肽键的光学活性，提供对α-螺旋和β-折叠等二级结构元素的洞察。
- NUV-CD（250–320 nm）：测量芳香族氨基酸侧链（例如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的圆二色性信号，可用于分析三级结构变化。
在仪器方面，两种技术均采用圆二色性光谱偏振仪，其核心组件相似，包括光源、单色器、偏振器、调制器和检测器。然而，样品制备和测量条件存在关键差异：
- FUV-CD：由于水在远紫外区域具有很强的吸收性，因此需要使用氧化氘 (D₂O) 作为溶剂。典型的样品浓度范围为0.1–1 mg/mL，光程长度为0.1–1 cm ，扫描范围为180–250 nm。
- NUV-CD：受水吸收的影响较小，可使用标准水性缓冲液。样品浓度通常为0.5–2 mg/mL，光程长度为1–2 cm ，扫描范围为250–320 nm。
这些区别突出了每种方法独特的技术考虑，使它们成为蛋白质结构研究中的互补工具。
5.2）蛋白质结构分析的差异
FUV-CD 和 NUV-CD 之间的主要区别在于每种技术研究的结构层面：
FUV-CD：专注于二级结构分析。它通过检测α-螺旋、β-折叠和无规卷曲对圆偏振光的吸收情况来量化这些元素的比例。这使得它在研究蛋白质折叠、构象变化和配体诱导的结构转变方面具有重要意义。
- 例如：在蛋白质折叠研究期间，FUV-CD 可以实时跟踪从展开状态到结构化状态的转变。
NUV-CD：通过检测芳香族氨基酸残基局部环境的变化，专注于研究三级结构动力学。这些测量有助于深入了解蛋白质稳定性、配体相互作用和构象重排。
- 例如：在药物研发中，NUV-CD 有助于评估配体结合如何改变蛋白质的三级结构，为基于结构的药物设计提供关键数据。
然而，每种方法都有局限性：
- FUV-CD 很难区分多亚基蛋白质中的结构域。
- NUV-CD 对芳香族残基较少的蛋白质缺乏敏感性。
这些因素使得必须根据具体的研究问题仔细选择适当的技术。
5.3）蛋白质研究中的补充用途
鉴于其独特的分析优势，结合 FUV-CD 和 NUV-CD 可以更全面地了解蛋白质结构和动力学：
蛋白质折叠研究：
- FUV-CD 跟踪实时二级结构形成。
- NUV-CD 监测蛋白质呈现其天然折叠时芳香残基环境的变化。
配体结合和药物发现：
- FUV-CD 评估配体诱导的二级结构改变。
- NUV-CD 检测结合位点的构象变化，有助于药物优化。
多域蛋白质分析：
- FUV-CD 揭示了域级折叠事件。
- NUV-CD 提供有关芳香侧链相对定位的信息。
通过利用这两种技术，研究人员可以获得对蛋白质行为的多层次理解，从而推动生物制药、结构生物学和精准医疗的进步。
六、案例研究
案例研究：FUV-CD 在蛋白质结构研究中的应用
FUV-CD揭示蛋白质-多酚相互作用
远紫外圆二色谱在研究蛋白质二级结构及其在不同条件下的动态变化中起着至关重要的作用。一个值得关注的应用是了解植物蛋白如何与多酚（例如茶多酚和表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)）相互作用。
案例1：植物蛋白-多酚复合物的结构调控
在对大豆球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂的研究中，FUV-CD揭示了多酚如何影响蛋白质构象。与黄酮类化合物结合后，观察到二级结构发生显著变化：
- β-折叠含量减少：FUV-CD光谱显示217nm处信号减弱，表明β-折叠结构减少。
- 无规卷曲含量增加： 200 nm处的信号更强， 表明无序性增加，这意味着蛋白质变得更加灵活。
这些发现表明，多酚通过氢键和疏水相互作用与蛋白质相互作用，从而增加蛋白质表面的亲水性。此类结构修饰可显著影响蛋白质的功能性，这在食品科学和药物制剂中尤为重要。
通过利用 FUV-CD，研究人员可以深入了解蛋白质稳定性、折叠机制和生物活性化合物相互作用，为改进功能性食品和药物应用铺平道路。
案例2：大肠杆菌黄素蛋白的辅因子结合机制
FUV-CD 是研究蛋白质-配体相互作用的有力工具，尤其有助于理解辅因子如何稳定蛋白质结构。一个关键的例子是它在研究大肠杆菌黄素蛋白 (Fld) 辅因子结合机制中的应用。
追踪 Apo-Fld 到 Holo-Fld 转换中的结构变化
黄素蛋白有两种形式：
- Apo-Fld（无辅因子形式）
- Holo-Fld（辅因子结合形式，含黄素单核苷酸（FMN））
FUV-CD光谱揭示了FMN结合过程中显著的二级结构变化：
- 增加α-螺旋含量： 208nm和222nm处的特征峰 变得更加明显，表明α-螺旋稳定。
- 稳定的 β 折叠结构： 217 nm处的信号 保持不变，证实 β 折叠区域没有发生显著改变。
这些结果表明 FMN 结合主要增强 α-螺旋稳定性，进而促进蛋白质-蛋白质相互作用和功能活性。
这两个案例研究凸显了 FUV-CD 在研究复杂生物系统方面的多功能性，从配体诱导的构象变化到疾病相关的蛋白质错误折叠（例如淀粉样蛋白原纤维的形成）。通过提供高分辨率光谱数据，FUV-CD 为蛋白质结构-功能关系提供了不可或缺的分子视角，有助于药物研发、酶学和生物物理学等领域的研究。
通过远紫外 CD 确定的大肠杆菌 Fld 的二级结构。
