蛋白质的三级结构是指所有氨基酸残基在整条肽链上的相对空间位置。一条多肽链在已经具有一定的α螺旋和/或β折叠区域的情况下，折叠成紧密堆积、近乎球形的空间结构，或称为天然构象。三级结构的形成和稳定性主要依赖于疏水键、盐键、二硫键、氢键等。
三级结构的一个重要特征是，在一级结构中距离较远的氨基酸残基在三级结构中可以非常接近，并且它们的侧链可以相互作用。二级结构由骨架中酰胺和羰基之间形成的氢键稳定，而三级结构主要由氨基酸残基侧链之间的非共价相互作用（主要是疏水相互作用）稳定。二硫键也有助于三级结构的稳定。在蛋白质的三级结构中，二级结构区域通过片段连接。
表征蛋白质三级结构的方法：
蛋白质的三级结构是蛋白质分子在自然折叠状态下的三维构象，是在二级结构的基础上进一步卷曲折叠形成的。三级结构表征对于蛋白质功能特性的研究至关重要。常用的表征方法包括X射线🩻衍射（XRD）、荧光光谱（FS）、近紫外圆二色谱（CD）和核磁共振（NMR）。
近紫外圆二色性（CD）
不对称微环境中的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）等芳香族氨基酸残基及其二硫键，在250～320nm近紫外区会呈现CD信号。
近紫外CD光谱的形状和大小受蛋白质中芳香族氨基酸的种类、环境(包括氢键、极性基团、极化率等)以及空间位置结构的影响。
近紫外CD光谱可作为一种灵敏的光谱探针，反映色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及二硫键等微环境的扰动，可用于研究蛋白质三级结构的细微变化。
荧光光谱（FS）
当某些物质受到一定波长的光照射时，会在短时间内发出比入射光波长更长的光，这种光称为荧光。蛋白质分子中含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）等带有苯环或共轭双键的氨基酸，这些氨基酸在一定的激发波长下能产生荧光，因此蛋白质具有内源性荧光。荧光光谱法可以测量蛋白质及反应体系的荧光强度，从而研究蛋白质在变性或复性过程中整体空间构象的变化。
核磁共振
NMR技术利用不同原子（1H或13C）的化学位移来重构原子间的化学连接，从而获取蛋白质的结构信息，进而在原子水平上揭示蛋白质的三维结构。NMR可用于分析大分子量样品，不受样品状态限制，且使用过程中无需结晶。此外，凭借其高分辨率，NMR在蛋白质三维结构的测定中得到广泛应用。
