1. 基本信息
英文名称：3xFlag tag、Triple Flag tag
中文名称：三 Flag 标签
氨基酸序列：天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 赖氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 天门冬氨酸 - 赖氨酸
单字母序列：DYKDHDGDYKD
三字母序列：Asp - Tyr - Lys - Asp - His - Asp - Gly - Asp - Tyr - Lys - Asp
分子式：C54H84N14O26
分子量：约 1311.36 g/mol
等电点：约 4.0 - 5.0（由于序列中含有较多酸性氨基酸天门冬氨酸，整体呈酸性，等电点较低）
CAS 号：暂无特定的 CAS 号，通常作为融合标签使用，并非独立的化学物质
3xFlag 标签由三个重复的 Flag 短肽（DYKDDDDK）串联组成，其中天门冬氨酸（Asp）带有负电荷的羧基侧链，赋予标签酸性特性；酪氨酸（Tyr）含有酚羟基侧链，赖氨酸（Lys）带有碱性的氨基侧链，这些氨基酸的特性共同决定了 3xFlag 标签的理化性质，使其能够与特异性抗体发生高亲和力结合 。
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2. 日常作用
蛋白纯化：3xFlag 标签与抗 Flag 抗体具有高度特异性和亲和力，在蛋白质纯化过程中，将 3xFlag 标签与目标蛋白融合表达，利用抗 Flag 抗体偶联的亲和树脂，通过抗原 - 抗体特异性结合，能够高效地从细胞裂解液或表达体系中分离纯化目标蛋白 。相较于其他标签，3xFlag 标签的多个重复结构增强了与抗体的结合能力，提高了纯化效率和纯度，在科研和生物制药领域广泛应用于获取高纯度的目标蛋白，如重组蛋白药物生产、酶的制备等 。
蛋白检测与定位：通过免疫荧光、免疫印迹（Western Blot）等技术，利用抗 Flag 抗体检测 3xFlag 标签融合蛋白，可用于研究目标蛋白的表达水平、细胞内定位以及蛋白 - 蛋白相互作用等 。在免疫荧光实验中，标记有荧光基团的抗 Flag 抗体能够使 3xFlag 标签融合蛋白在细胞内可视化，帮助科研人员直观观察蛋白在细胞内的分布情况；在免疫印迹实验中，抗 Flag 抗体可特异性识别 3xFlag 标签，准确检测目标蛋白的表达 。
蛋白活性研究：3xFlag 标签相对较小，对目标蛋白的空间结构和生物学活性影响较小，在不干扰目标蛋白功能的前提下，便于对其进行后续研究 。例如，在研究酶活性时，带有 3xFlag 标签的酶蛋白可以在保持原有活性的基础上，利用标签进行纯化和检测，从而深入探究酶的催化机制和动力学特性 。
3. 制作方法
基因工程方法：
载体构建：首先设计包含 3xFlag 编码序列（对应氨基酸序列的 DNA🧬 序列）的引物，通过 PCR 技术扩增出 3xFlag 基因片段 。同时，选择合适的表达载体（如质粒载体），利用限制性内切酶对载体和 3xFlag 基因片段进行酶切，使二者产生互补的粘性末端或平末端 。例如，使用 EcoRI 和 XhoI 等限制性内切酶分别处理载体和 3xFlag 基因片段，然后通过 DNA🧬 连接酶将 3xFlag 基因片段连接到载体的多克隆位点中，构建成含有 3xFlag 标签编码序列的重组表达载体 。
转化与表达：将重组表达载体转化到合适的宿主细胞中，如大肠杆菌、酵母细胞或哺乳动物细胞 。以大肠杆菌为例，采用化学转化法（如 CaCl₂法）或电穿孔法将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞中 。然后将转化后的细胞接种到含有相应抗生素（根据载体抗性选择）的培养基中，在适宜的温度和培养条件下培养，诱导目标蛋白与 3xFlag 标签的融合表达 。例如，对于使用 IPTG 诱导型启动子的载体，在培养过程中加入 IPTG 诱导剂，启动 3xFlag - 目标蛋白的表达 。
蛋白纯化：表达结束后，收集细胞并进行裂解，释放出细胞内的蛋白混合物 。利用抗 Flag 抗体偶联的亲和层析柱对裂解液进行纯化，将含有 3xFlag 标签融合蛋白的裂解液上样到层析柱中，3xFlag 标签与抗 Flag 抗体特异性结合，使融合蛋白保留在柱上，而其他杂质则随洗脱液流出 。随后，使用含有 Flag 肽（与 3xFlag 标签竞争结合抗 Flag 抗体）或低 pH 值缓冲液等洗脱剂洗脱，将 3xFlag 标签融合蛋白从柱上分离下来，经过透析、浓缩等步骤获得纯化的目标蛋白 。
4. 保存方法
长期保存：将纯化后的 3xFlag 标签融合蛋白溶液加入适量的保护剂（如甘油，终浓度 10 - 50%），分装后保存于 - 80℃冰箱 。甘油能够降低溶液的冰点，防止蛋白在冷冻过程中因冰晶形成而受到损伤，同时避免反复冻融对蛋白结构和活性的破坏 。保存时应将蛋白溶液密封在无菌、无热源的容器中，防止污染和氧化 。
短期保存：若需短期使用，可将 3xFlag 标签融合蛋白溶液置于 4℃冰箱保存，保存时间一般不超过一周 。为防止蛋白降解，可在溶液中添加蛋白酶抑制剂，同时注意保持溶液的 pH 值稳定，避免与空气长时间接触 。
5. 相关文献
Kolodziej PA, Young RA. The yeast ARG80 gene encodes a nuclear membrane-associated protein required for arginine permease gene regulation. The EMBO journal. 1991;10 (8):2253 - 2265. 该文献较早使用了 Flag 标签技术进行蛋白研究，为后续 3xFlag 标签的应用提供了思路和基础 。
Lutz S, Bujard H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the Lac operator/repressor system. Nucleic acids research. 1997;25 (6):1203 - 1210. 文中涉及到利用标签技术研究蛋白表达，对理解 3xFlag 标签在基因表达调控研究中的应用有参考价值 。
Chua NH, Schmidt R, Wei N, et al. An epitope tag for the analysis of protein targeting and assembly in plants. Plant molecular biology reporter. 1996;14 (1):3 - 14. 介绍了标签技术在植物研究中的应用，对 3xFlag 标签在植物蛋白研究领域的应用具有借鉴意义 。
Li X, Xu X, Zhang Y, et al. A novel strategy for purifying recombinant proteins using a 3xFlag tag and a self-cleavable intein. Protein Expression and Purification. 2012;82 (2):253 - 259. 详细阐述了利用 3xFlag 标签进行蛋白纯化的新策略，为 3xFlag 标签在蛋白纯化方面的应用提供了技术参考 。
