在复杂且快速发展的结构生物学领域，关键挑战之一仍然是阐明分子结构并详细了解这些结构如何决定生物功能。X射线晶体学、冷冻电镜 (cryo-EM)和核磁共振 (NMR) 光谱等技术已成为结构生物学的基石，为了解蛋白质、核酸和其他生物分子的空间组织提供了无与伦比的洞察力。在众多可用的互补方法中，紫外 (UV) 和红外 (IR) 光谱也发挥着重要作用，特别是在分子表征、构象变化和功能分析方面。尽管紫外、红外和核磁共振光谱的共同目标都是提供详细的分子信息，但它们的原理、技术和提供的信息类型有着根本的不同。
每种光谱方法都能揭示分子结构和行为的不同方面。紫外光谱对于研究电子跃迁和发色团相互作用至关重要，红外光谱可以揭示功能团的振动运动，而核磁共振光谱则可以提供原子级结构和动力学的高分辨率信息。对于想要使用最有效工具进行研究的研究人员来说，了解这些技术之间的差异至关重要。
一、紫外光谱：探索电子跃迁
紫外 (UV) 光谱法是一种测量分子对紫外光吸收的技术，有助于了解分子内部发生的电子跃迁。紫外光谱法的基础是分子吸收紫外光后，电子从低能态（基态）激发到高能态（激发态）。该技术对含有共轭 π 键体系或吸收紫外区域（通常为 200-400 nm）光的发色团的分子的电子特性特别敏感。
紫外光谱的三种典型图
在紫外可见光谱中，描述紫外可见光照射下电子跃迁的三个典型图表是：
- 吸收光谱：该图显示样品的吸光度（y 轴）与波长（x 轴）的关系。它表示样品吸收紫外光或可见光的波长。吸收峰对应于电子跃迁所需的能量。在紫外-可见光区域，光谱通常显示与分子轨道跃迁相关的吸收带，例如 π → π*、n → π* 和 σ → σ* 跃迁。
- 电子能级图：该图表示分子内电子的能级。它通常显示基态（最低能量）和激发态（较高能级）。在吸收紫外-可见光时，分子中的电子会从较低能量的分子轨道（例如 HOMO，最高占据分子轨道）跃迁至较高能量的分子轨道（例如 LUMO，最低未占据分子轨道）。此类图直观地展示了紫外-可见光照射下发生的电子跃迁类型（例如 π → π*、n → π* 或 σ → σ*）。
- 雅布隆斯基图：雅布隆斯基图主要用于荧光和磷光研究，但它也显示了分子的电子能态。在紫外-可见光吸收的背景下，它表示光子吸收后的激发态。该图描绘了基态和激发态之间的跃迁，并显示了潜在的弛豫途径，例如非辐射衰变、荧光和磷光。它有助于说明吸收的紫外-可见光如何促进电子跃迁，以及如何从激发态释放能量。
图1. 紫外-可见光照射下紫外-可见光和电子跃迁的三种典型示意图。
仪器仪表：组成
现代紫外可见光分光光度计由多个关键部件组成，这些部件决定了其在各种应用中的精度、准确度和多功能性。这些部件包括：
- 光源：分光光度计需要稳定且持续的紫外和可见光波长光源。氘灯可在紫外 (UV) 范围（通常为 190–400 nm）内提供稳定的输出，而钨丝灯或卤素灯则可覆盖可见 (Vis) 光谱（400–1100 nm）。一些先进的仪器会配备氙气闪光灯，可提供更宽的光谱范围和更长的使用寿命。
- 单色仪：为了分离特定波长，单色仪使用衍射光栅或棱镜。衍射光栅因其更高的分辨率和波长精度，能够最大程度地减少杂散光干扰，在现代仪器中更为常用。
- 样品容器：样品室包含盛放液体样品的比色皿。石英比色皿因其在紫外波段的透明度而更适合紫外测量，而玻璃或塑料比色皿则适用于可见光应用。一些先进的分光光度计支持光纤探头，可直接进行原位样品测量。
- 检测器：检测器将透射或吸收的光转换为电信号。光电倍增管 (PMT) 灵敏度高、响应迅速，是检测低强度光的理想选择。光电二极管阵列 (PDA) 可同时进行多波长测量，从而提高速度和效率。
结构生物学中的紫外光谱
在结构生物学中，紫外光谱法广泛用于研究芳香族氨基酸，例如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，这些氨基酸在蛋白质结构中含量丰富，并作为内在发色团。这些氨基酸的吸收光谱提供了有关蛋白质折叠、构象变化以及与其他分子相互作用的关键信息。例如，紫外吸收峰的偏移可以指示芳香族残基周围环境的变化，这种变化可能发生在配体结合、蛋白质折叠或蛋白质-蛋白质相互作用过程中。
jrhz.info
图2.芳香族氨基酸的光谱密度曲线:色氨酸 (Trp)、酪氨酸 (Tyr)、苯丙氨酸 (Phe) 和源自牛血清 (BSA) 的白蛋白。
紫外光谱法也可用于定量核酸和蛋白质的浓度，它通过测量特定波长（通常核酸为260 nm，蛋白质为280 nm）的吸光度来实现。在结构生物学中，这项应用至关重要，因为它可以在使用更先进的技术进行进一步分析之前评估样品的质量。此外，紫外光谱法还可以通过分析远紫外区域（190-250 nm，肽键在此吸收）的光吸收情况，提供蛋白质二级结构的数据。
图 3. 简单的紫外/可见光吸收光谱，显示峰值吸收波长λmax ，其强度由摩尔消光系数ϵ给出，其计算模拟量为振荡强度f。
尽管紫外光谱法用途广泛，但它在提供生物分子详细三维结构信息方面的能力有限。虽然它可以指示构象变化和特定发色团的存在，但它无法提供原子级分辨率，也无法解析键角或键距等复杂的结构特征。此外，紫外光谱法不适用于研究缺乏发色团或在紫外范围内无吸收的生物分子。
二、红外光谱：探测分子振动
与紫外光谱不同，红外 (IR) 光谱专注于分子内原子的振动运动。当红外辐射穿过样品时，样品中的分子会吸收特定频率的能量，这些频率与分子内化学键的振动模式相对应。这些振动发生在特征频率上，具体取决于所涉及原子的质量和键的强度。因此，红外光谱可以提供有关分子中存在的功能基团及其周围分子环境的信息。
图4. 溴甲烷中C-H键的对称拉伸-压缩模式。
傅里叶变换红外（FTIR）光谱
傅里叶变换红外 (FTIR) 光谱法是一种强大的分析技术，它利用干涉法代替单色仪来测量样品对红外光的吸收，从而增强了传统的色散红外 (IR) 光谱法。该方法可以对各种材料进行更快、更灵敏、更高分辨率的光谱分析，使其成为化学、制药、材料科学和环境分析等领域的必备方法。
关键部件及工作原理
- 迈克尔逊干涉仪：FTIR 光谱仪的核心是迈克尔逊干涉仪，它由分束器、固定镜和移动镜组成。分束器将红外光分成两条路径：一条路径指向固定镜，另一条路径指向移动镜。当这些光束重新组合时，它们会产生干涉图，这是一种包含红外光谱中所有波长信息的复杂信号。
- 傅里叶变换：生成的干涉图是时间（或反射镜位置）的函数。傅里叶变换 (FT) 算法用于将时域数据转换为更常见的频域光谱，该光谱绘制的是吸收强度与波数（cm⁻¹）的关系。这种变换可以同时检测所有红外频率，从而显著提高数据采集速度和光谱分辨率。
FTIR 相对于色散红外光谱的优势
- 更高的信噪比 (SNR)：多路复用 (Fellgett) 优势允许同时收集多个数据点，从而提高灵敏度。
- 快速扫描和实时分析：同时测量所有波长的能力可以实现更快的光谱采集，使 FTIR 成为高通量应用的理想选择。
- 提高分辨率：FTIR 提供比传统色散红外光谱仪更高的光谱分辨率，可以区分间距很近的吸收带，这在分析复杂混合物时至关重要。
- 提高对弱吸收的灵敏度：由于其更高的能量吞吐量，FTIR 能够更有效地检测弱吸收功能团，即使在低浓度样品中也是如此。
结构生物学中的红外光谱
在结构生物学中，红外光谱法对于研究蛋白质的二级结构和生物分子的构象动力学尤为有用。例如，酰胺I带（约1600-1700 cm⁻¹）对应于肽骨架的C=O伸缩振动，常用于测定蛋白质中α-螺旋和β-折叠的含量。酰胺II带（约1500 cm⁻¹）提供了有关蛋白质结构的更多信息，因为它与NH弯曲和CN伸缩振动有关。这些特征对于表征蛋白质折叠、构象变化和蛋白质-配体相互作用至关重要。
红外光谱也可用于研究核酸，尽管其在核酸中的应用不如在蛋白质中那么普遍。核酸的振动模式，尤其是在1200-1300 cm⁻¹范围内，有助于了解RNA和DNA的构象变化，包括不同双螺旋结构之间的转变以及小分子的结合。
图5. 典型的生物光谱，显示了3,000–800 cm −1范围内生物分子峰的归属，其中ν = 伸缩振动，δ = 弯曲振动，s = 对称振动，as = 非对称振动。该光谱为来自人类乳腺癌（导管原位癌）的透射型微光谱。样本经冷冻切片（8 μm厚）并封片于BaF2载玻片（1 mm厚）上，然后进行红外显微光谱分析。
红外光谱法的主要优势在于它能够研究溶液中的分子，而无需像X射线晶体学等技术那样需要高浓度或晶体形态。然而，红外光谱法也有其局限性。其光谱分辨率通常不足以提供原子层面的详细信息，而且该技术容易受到样品异质性的影响。此外，虽然红外光谱法非常适合观察官能团振动，但它无法像其他技术那样直接提供有关原子相互作用或三维结构的信息。
三、核磁共振波谱：原子分辨率结构信息
核磁共振 (NMR) 光谱法与紫外光谱法和红外光谱法不同，它能够提供溶液中生物分子的高分辨率原子级结构信息。NMR光谱法基于原子核与外部磁场和射频辐射的相互作用。某些原子核，尤其是氢原子 (¹H) 和碳原子 (¹³C)，具有磁性，可以在磁场中观察到。通过测量这些原子核与磁场相互作用时的能量跃迁，NMR 可以提供有关分子中原子的化学环境、连通性和空间排列的详细信息。
图6. NMR原理示意图。
结构生物学中的核磁共振波谱
在结构生物学中，NMR是研究溶液中中小型蛋白质、核酸和其他生物分子三维结构的黄金标准。与需要生物分子晶体的X 射线晶体学不同，NMR 可以研究接近天然动态的分子，使其成为研究柔性
或难以结晶的蛋白质和核酸的理想方法。NMR 数据可以提供有关原子间距、扭转角和分子整体折叠的详细信息。
图7. 反胶束密闭环境中细胞色素c（A）和钙调蛋白（B）的溶液NMR结构。
图 8. 核磁共振 (NMR) 显示的模型 DNA（二级）结构：(a) B-DNA (PDB ID: 1ZF7)；(b) G-四链体 (PDB ID: 139D)；(c) i-基序 (PDB ID: 1A83)；(d) AGCGA-四链体 (PDB ID: 5M1L)；以及 (e) G-发夹结构 (PDB ID: 5M1W)
核磁共振波谱法依赖于对化学位移、标量耦合和核欧沃豪斯效应 (NOE) 相互作用的分析来确定分子的三维结构。化学位移源于原子核周围的电子密度，并且对局部环境高度敏感，例如附近官能团的存在或原子的空间排列。标量耦合反映了耦合原子核之间的相互作用，而 NOE 相互作用提供了空间距离约束，可用于计算分子内原子的相对位置。
图 9. (A) 能量图显示J耦合对氟化氢分子的影响。(B) 化学位移示例：六硼烷 B 6 H 10的核磁共振谱显示峰频率发生偏移，这为分子结构提供了线索（点击阅读解释详情）。(C) 核欧沃豪斯效应。
NMR 提供原子级结构信息的能力是无与伦比的，尤其是与 2D、3D 和4D NMR等多维 NMR 技术相结合时。这些技术使研究人员能够获得高维数据，可用于生成蛋白质-配体相互作用、构象变化和蛋白质折叠的详细模型。
NMR 的一大优势在于其能够研究生物分子动力学。通过追踪化学位移和弛豫时间的变化，NMR 可以深入了解生物分子的柔韧性和运动，例如在酶催化或配体结合过程中发生构象变化的蛋白质。此外，NMR 在研究蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用方面也发挥着重要作用，能够提供有关这些相互作用的结合位点、亲和力和动力学的详细信息。
然而，核磁共振波谱法也面临挑战。虽然核磁共振波谱法能够进行高分辨率结构测定，但它需要相对较高的样品浓度，并且由于光谱重叠和信号衰减，对较大的生物分子（例如 >40 kDa）的分析会变得困难。此外，核磁共振数据的解释计算量巨大，需要复杂的算法从波谱中提取结构和动态信息。
四、紫外光谱、红外光谱和核磁共振光谱之间的主要区别
