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想象一下，把一整座城市夜景压缩进一张邮票，而你只能点亮四盏路灯——这就是传统免疫荧光的尴尬：一次最多 3–4 种蛋白，像用四支水彩笔描绘北京。
这种处境来自于抗体组合的组成和图像分辨率的限制，它们共同限制了图像分析的范围。但就在最近，由丹麦奥胡斯大学（Aarhus University）与德国汉堡埃彭多夫医学中心 Center for Molecular Neurobiology Hamburg (ZMNH)等共同带来了一种名为「PathoPlex」的病理导向多路复用框架，它不仅解决了这些问题，还能以前所未有的方式揭示组织内部的蛋白质空间分布。
该研究以「Pathology-oriented multiplexing enables integrative disease mapping」为题，于 2025 年 7 月 18 日刊登在《Nature》。
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-025-09225-2
高通量与高分辨率的完美结合
PathoPlex 的技术核心优势在于其突破性的高通量和高分辨率成像能力，结合了免疫荧光染色与图像分析，能够在亚细胞分辨率下同时检测多个蛋白质的空间分布。
具体而言，在一项实验中，研究人员进行了多达95轮成像，在每个像素 80 纳米的分辨率下同时映射超过 140 种商业抗体，整个过程中，他们共生成了超过6000亿个像素的数据，这些数据揭示了多层次、多维度的蛋白质空间表达模式，而这尚未到达极限。
图示：PathoPlex。（图源：论文）
为了高效处理如此庞大的数据量，团队开发了「spatiomic」开源软件包，该软件能够利用 GPU 加速图像分析，进行配准、降维和聚类等操作，使得数据处理不再成为瓶颈。
原理验证与概念验证
PathoPlex 的质量控制标准首先在小鼠组织中建立，然后扩展到人类标本。
抗体面板连续成像周期是第一级控制，防止不完全洗脱导致的后续周期内的交叉反应或者信号残留。
第二级控制涉及在洗脱后直接成像以确认是否缺失荧光信号，第三级包括使用未预先孵育一抗的二级抗体成像周期。这一步确保了一抗的残留活性不存在，并生成了可以包含在图像分析中的额外层。
第四级控制涉及在多个成像周期后成功重新染色。这一步用于确认表位的保存和抗体洗脱的有效性。
这种策略在仅使用二级循环时就显示了几近完美的洗脱率，并在 60 个循环后有效进行了重新染色。
所有成像周期完成后，需要对图像进行对齐，以弥补各个周期中可能出现的位移。
接下来的概念验证，研究团队使用 PathoPlex 分析了小鼠从急性损伤到新月体性肾小球肾炎（CGN）的明确疾病过程。
图示：鉴定上皮 JUN 活性作为免疫介导肾脏疾病的关键开关。（图源：论文）
在实验中，共使用了 34 个标记物，以每像素 80 纳米的分辨率获取约 50 亿像素。来自同一动物的额外组织病理学切片由两位经验丰富的肾病病理学家进行盲法评估，结果与框架相吻合。
对于糖尿病肾病（DKD）的研究，PathoPlex 揭示了钙相关的肾小管压力应激现象，这些现象可能是糖尿病早期肾脏损伤的重要标志。
在实验验证中，研究人员通过对比糖尿病患者与正常肾脏组织，发现糖尿病肾脏中的应激标志物（如钙离子通道蛋白）的表达水平明显升高，尤其在早期阶段未见显著的结构变化，但蛋白质表达已发生变化。
图示：PathoPlex 作为分析人类 DKD 的工具。（图源：论文）
结合这些发现，PathoPlex 不仅帮助验证了糖尿病肾病的早期生物标志物，也为早期干预策略提供了理论支持。
更广阔的精准医学应用
PathoPlex 技术的出现不仅提供了一种全新的研究工具，也为精准医学的实现提供了坚实的技术基础。通过高通量成像和强大的数据分析能力，研究人员能够以前所未有的方式深入解析组织中蛋白质的分布、表达模式和相互作用。
但是当下它还面临着如何处理每一轮成像及数据处理中所需的高昂成本，以及随着抗体面板的扩展，如何保持数据的一致性与质量等难题。
在未来的研究中，需要让图像分析工具进一步适应越来越大、越来越复杂的数据集，可以考虑通过机器刃自动化等方式增加样本量。随着技术的进一步优化和应用领域的扩展，PathoPlex 有望成为精准医学的重要工具，为疾病的早期诊断和治疗提供强大的支持，并加速药物研发进程。
