本研究旨在解决传统水凝胶生物墨水3D生物打印后难以快速稳定、分辨率和保真度低的问题,开发了具有剪切变稀和自修复特性的氧化和甲基丙烯酸酯化海藻酸盐(OMA)生物墨水。该墨水通过钙离子交联实现快速自修复稳定,再经光交联增强力学性能,成功打印出高分辨率(filament直径223-361μm)、高保真度(92-110%)的复杂结构(如悬垂结构、耳朵模型等)。负载的人骨髓间充质『干细胞』(hMSCs)存活率高,且在长期培养中可分化为软骨组织,为复杂功能组织工程提供了有效平台。
思维导图
1.研究背景与挑战
水凝胶的应用基础:水凝胶是亲水性聚合物的 3D 网络,因生物相容性好、可模拟细胞外基质(ECM),广泛用于组织工程,但传统水凝胶难以打印出复杂、高精度的 3D 结构。
3D 生物打印的核心问题:多数水凝胶生物墨水挤出后无法快速稳定,导致分辨率低、保真度差,难以形成自支撑结构,限制了其在复杂组织构建中的应用。
研究目标:开发新型水凝胶生物墨水,需满足高打印分辨率和保真度、可调力学性能和降解速率、高细胞活力。
2. OMA 生物墨水的制备
OMA 的合成:通过海藻酸盐的氧化(使用高碘酸钠)和甲基丙烯酸酯化(使用 2 - 氨基乙基甲基丙烯酸酯)制备,可调节氧化度(1%、2%)和甲基丙烯酸酯化度(5%、10%、20%)。
生物墨水配制:2 w/v% OMA 溶于 DMEM,添加 0.05 w/v% 光引发剂;与不同浓度硫酸钙 slurry(0-210.0 mg/ml)混合,通过钙离子交联形成初始结构,后续可经紫外光(20 mW/cm²,1 min)二次交联增强稳定性。
3. 3D 生物打印系统与流程
打印机🖨️改装:改装 Printrbot 打印机🖨️,替换为注射器💉泵挤出系统,兼容 Cura 软件;同时使用商用打印机🖨️(Biobot Basic、Bio X™)。
打印参数:使用 22G、25G、27G 针头,通过对应软件控制,打印结构包括立方体、字母、耳朵、悬垂结构(碗、桥等)。
4. OMA 生物墨水的关键性能(流变学特性)
性能指标
具体表现
意义
剪切变稀
黏度随剪切率升高而降低
便于通过针头挤出,降低对细胞的剪切损伤
剪切屈服应力
<5 Pa
只需小应力即可流动,提升打印操作性
储能模量(G')
G' > 损耗模量(G''),机械稳定性好
保证打印结构初始稳定性
自修复特性
循环应变测试中,100% 应变下变为液态,1% 应变下秒级恢复固态
打印后快速稳定,防止结构坍塌
由高粘度海藻酸盐合成的OMA(1OX20MA)生物油墨的表征。OMA生物墨水的粘度测量与(a)剪切力的关系速率和(B)剪应力分别表明了其剪切减薄和剪切屈服行为。(C)OMA-15[OMA+15μl CaSO4(1.22M)]、(D)OMA-20[OMA+20μl CaSO4(1.22 M)]、(E)OMA-25[OMA+25μl CaSO_4(1.22 M])和(F)OMA-40[OMA+40μl CaS04(1.22M)]生物墨水表明OMA生物墨水具有机械稳定性。(G)OMA-15、(H)OMA-20、(I)OMA-25和(J)OMA-40生物墨水的应变扫描测试。OMA的G′和G′′交叉生物墨水作为剪切应变的函数,在较高的剪切应变下表现出凝胶到溶胶的转变。(K)OMA-15、(L)动态应变试验期间剪切模量的变化OMA-20、(M)OMA-25和(N)OMA-40生物墨水在1 Hz下具有交替的低(1%)和高(100%)应变,表明它们在固体样之间快速过渡并且在几秒钟内表现出类似液体的行为,这表明具有自愈或触变特性。(O)使用BioX打印机🖨️上的OMA生物墨水的3D打印结构(5×5×3 mm)的照片。
5. 3D 打印效果:分辨率与保真度
高分辨率:随针头内径减小(22G:413μm→27G:210μm),打印 filament 直径相应减小(361μm→223μm),为针头内径的 88-106%。
高保真度:10×10×5 mm 立方体打印后,尺寸保真度达 92-110%;复杂结构(UIC 标志、耳朵)及悬垂结构(无需支撑)均能精准打印
6.细胞活性与功能分化
细胞活力:hMSCs 负载浓度为 5×10⁶ cells/ml,打印及光交联后,Live/Dead 染色显示高存活率。
软骨分化:在软骨诱导培养基中培养 4 周后,甲苯胺蓝染色呈强阳性(紫色),GAG/DNA🧬 含量显著高于对照组(p<0.05),观察到软骨陷窝结构,表明形成功能性软骨组织。
使用改良的Printrbot打印机🖨️与由高粘度藻酸盐合成的负载hMSC的OMA生物墨水区分3D生物打印构建体。代表性的(A)活的、(B)死的和(C)在第0天的光交联3D打印结构的合并显微照片。在光交联之前和之后使用负载hMSC的OMA生物墨水(D)3D打印耳朵。甲苯胺蓝O染色前后软骨分化的3D打印耳朵(F)和(G)。在(H)软骨生成(Chondro)和(I)生长培养基(对照)中培养的甲苯胺蓝O染色构建体切片的显微照片。(J)3D打印构建体中GAG/DNA🧬的定量。白色、红色和黑色刻度条分别表示200μm、1 cm和100μm。*与对照组相比,p<0.05。
7.结论
OMA 生物墨水凭借剪切变稀、自修复及双重交联特性,解决了传统水凝胶打印的关键挑战,实现高分辨率、高保真复杂结构(包括悬垂结构)的打印。
负载的 hMSCs 可存活并分化为功能组织,为组织工程和再生医学提供了高效、可扩展的平台。
关键问题:
问题:OMA生物墨水相比传统水凝胶生物墨水,在3D打印中解决了哪些核心缺陷?
答案:传统水凝胶生物墨水存在打印后难以快速稳定、分辨率和保真度低、无法支撑复杂结构(如悬垂结构)的缺陷。OMA生物墨水通过剪切变稀特性实现顺利挤出,快速自修复特性(秒级恢复机械性能)确保打印后立即稳定,双重交联(钙交联+光交联)增强力学性能,从而实现高分辨率(filament直径223-361μm)、高保真度(92-110%),并能打印无需支撑的悬垂结构,克服了传统缺陷。
问题:研究中如何验证OMA生物墨水打印结构的功能可行性?
答案:通过『干细胞』负载与分化实验验证功能可行性:① 负载的 hMSCs在打印及光交联后存活率高;② 在软骨诱导培养基中培养4周,打印结构保持高保真度,甲苯胺蓝染色显示GAG富集(强阳性),观察到软骨陷窝结构;③GAG/DNA🧬含量显著高于对照组(p<0.05),证明hMSCs成功分化为功能性软骨组织,验证了打印结构的功能可行性。
问题:OMA生物墨水的双重交联机制(钙交联+光交联)分别发挥了什么作用?
答案:① 钙交联:通过钙离子与OMA的ionic作用实现初始交联,赋予墨水剪切变稀和自修复特性,确保打印过程中顺利挤出且打印后快速稳定,维持结构初步形态;② 光交联:通过紫外光(20 mW/cm²,1 min)引发甲基丙烯酸酯基团聚合,形成共价交联网络,增强结构的长期力学稳定性和降解抗性,支持『干细胞』长期培养和功能分化。两者结合实现了打印便捷性与结构长效性的平衡。
