葡萄糖代谢是肿瘤生物学的基石，为癌细胞指数级增殖提供能量支持。因此，通过低碳水化合物（LC）饮食等方式靶向葡萄糖代谢，已成为抑制肿瘤生长的潜在策略。在肿瘤内部，癌细胞激烈争夺葡萄糖常导致局部区域葡萄糖耗竭。传统研究将肿瘤视为均质实体，忽视了不同区域间显著的代谢异质性。这引出一个关键问题：癌细胞中的葡萄糖剥夺是否会影响仍能获取葡萄糖的邻近细胞命运？探索这种"旁观者效应"，可能揭示葡萄糖代谢对肿瘤进展和治疗结果的真实影响，为开发更精准有效的代谢靶向策略铺平道路。
2025年7月15日，中山大学生命科学学院邝栋明教授、魏瑗副教授团队（吴财源博士、黄春祥博士、中山大学肿瘤防治中心劳向明主任医师为共同第一作者）在Cell上发表了题为：Glucose Restriction Shapes Pre-Metastatic Innate Immune Landscapes in Lung through Exosomal TRAIL的研究文章。研究利用单细胞转录组、空间转录组、转录组、多重免疫荧光等多种技术对葡萄糖剥夺下肝癌转移至肺的机制进行深入的研究，发现了葡萄糖剥夺的“双刃剑”作用：虽然可以抑制肿瘤的生长，但是促进了独立于肿瘤生长的异位转移。
1. 葡萄糖剥夺是否会导致癌症复发和转移？
1.1 葡萄糖剥夺是否导致癌症复发？
研究采用基因集变异分析(GSVA)，基于KEGG的hsa00010通路，从TCGA中获取22种癌症类型2514例手术时未检测到转移的初治患者的肿瘤样本进行了葡萄糖代谢活性评估，研究其对术后2年复发的影响，这种复发可能由不可检测的前转移病灶驱动。
与预期相反，在所分析的癌症类型中增强的葡萄糖代谢活性并未带来显著的复发风险，而其中15种癌症类型，低葡萄糖代谢活性被发现与患者术后2年复发相关或可能相关。
1.2 葡萄糖剥夺是否会导致癌症转移？
在人类肝细胞癌(HCC)样本中，术后2年内发生肺转移患者的肿瘤组织确实表现出明显较低的葡萄糖代谢活性(图B)。这一模式通过多种检测方法得到一致重现，包括氟代脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(FDG-PET)成像(图C)、乳酸脱氢酶(LDH)活性测定(图D)以及肿瘤区域的空间转录组分析(图B)。
研究利用高碳水化合物(HC)和低碳水化合物(LC)饮食喂食五种原位小鼠肿瘤模型(肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、结肠腺癌和胃癌)。HC饮食确实加速了肿瘤生长，而LC饮食则抑制了肿瘤生长，这与葡萄糖代谢支持肿瘤快速生长的传统认知一致。与假设一致，LC饮食显著增强了所有肿瘤类型的肺转移，尽管HC饮食也促进了肺转移(图F)。值得注意的是，LC饮食诱导的肺转移独立于原发肿瘤生长而发生，而HC饮食诱导的转移与原发肿瘤扩张密切相关(图G)。这一结论在自发性肝癌实验中得到了进一步验证(图H)。因此，葡萄糖剥夺或LC饮食促进肺转移独立于原发肿瘤生长，甚至促进早期癌症转移。
2. 葡萄糖剥夺如何促进肝癌的肺转移？
2.1 葡萄糖剥夺癌细胞发生自身转移还是正常癌细胞转移？
研究通过稳定敲低Slc2a1、Hk2、Pkm、Pfkl和Ldha等糖酵解关键基因，构建了葡萄糖代谢缺陷型Hepa1-6肝癌细胞克隆。这些克隆虽生长速率降低（图J），但未表现出更强的肺转移能力（图I），其迁移能力也未见改变（图M）。
鉴于肝癌肿瘤区域葡萄糖代谢活性的异质性，将葡萄糖代谢缺陷型Hepa1-6克隆与荧光素酶标记的正常Hepa1-6细胞共接种于小鼠肝脏。葡萄糖代谢缺陷克隆显著促进了荧光素酶标记的正常肝癌细胞的肺转移；相反通过敲除谷氨酰胺转运体SLC1A5构建的谷氨酰胺代谢缺陷型Hepa1-6克隆则几乎无此效应（图L）。值得注意的是，在体外实验中，葡萄糖代谢缺陷型Hepa1-6细胞既不能增强正常肝癌细胞的迁移能力，也无法上调上皮-间质转化相关基因Vim和Cdh1的表达。
2.2 葡萄糖剥夺的癌细胞是否先塑造了肺部的转移前微环境？
通过对荷瘤（Hepa1-6肝癌）小鼠肺组织中CD45+造血细胞进行scRNA-seq。细胞分群结果发现低碳水化合物（LC）饮食导致巨噬细胞明显聚集，同时自然杀伤（NK）细胞（尤其是功能性NK细胞）选择性减少（图A-B）。流式细胞术分析进一步验证了这些结果（图C-E）。
在携带葡萄糖代谢缺陷型Hepa1-6克隆的小鼠肺组织中，也观察到类似的巨噬细胞累积和NK细胞缺失模式。与之对应，在人类转移性肝癌的肺组织中，与健康肺组织相比，也同样观察到巨噬细胞浸润增加而NK细胞数量减少（图F）。值得注意的是，LC饮食对荷瘤小鼠肺组织中适应性免疫细胞（包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞和浆细胞）的浸润仅有轻微影响（图A）。在缺乏成熟B淋巴细胞和T淋巴细胞的严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠中发现，LC饮食同样显著增强了肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、结肠腺癌和胃癌的肺转移（图G）。这些结果表明，葡萄糖剥夺可能塑造了一个以巨噬细胞为主导、NK细胞缺失为特征的转移前微环境。
进一步采用多重荧光染色技术追踪荷瘤小鼠肺组织中免疫细胞的动态浸润过程（图H）。分析显示，在LC饮食干预仅3天后，肺巨噬细胞数量即翻倍并趋于稳定；与之形成鲜明对比的是，NK细胞数量在LC饮食6天后开始急剧下降，至第9天时减少达70%（图I-J）。常规饮食组小鼠的肺巨噬细胞和NK细胞数量仅呈现轻微波动（图I-J）。此外，LC饮食对其他肺组织免疫细胞亚群的浸润未产生动态影响。通过对比巨噬细胞与NK细胞的数量变化动力学，发现LC饮食组荷瘤小鼠肺组织中巨噬细胞的聚集早于NK细胞的缺失。为验证这一发现，使用CSF1受体（CSF1R）靶向抗体清除肺巨噬细胞，结果成功缓解了LC饮食诱导的NK细胞数量减少及细胞内颗粒酶B下调（图K-L）。在携带葡萄糖代谢缺陷型Hepa1-6克隆的小鼠中也观察到类似现象。值得注意的是，清除LC饮食荷瘤小鼠的肺巨噬细胞还能抑制肝癌肺转移（图M），而该保护效应可被同步清除NK细胞所逆转（图N）。这些证据表明，原发瘤的葡萄糖剥夺会形成以巨噬细胞介导的NK细胞缺失与功能缺陷为主导的转移前微环境。
3. 肝癌中葡萄糖剥夺后肺巨噬细胞如何导致NK细胞缺失？
对Hepa1-6荷瘤小鼠肺组织的scRNA-seq进行细胞互作分析显示，PVR-TIGIT轴是巨噬细胞与NK细胞间最活跃的抑制性信号通路（图A）。值得注意的是，PVR是这些小鼠肺巨噬细胞中上调最显著的自然杀伤抑制性配体（图B）。共聚焦显微镜进一步证实PVR表达主要局限于F4/80+巨噬细胞，在基质细胞和上皮细胞中表达极低（图C）。这种PVR+巨噬细胞的增加仅见于LC饮食的荷瘤小鼠，而未在无肿瘤对照组中观察到（图D）。同样，注射葡萄糖代谢缺陷型Hepa1-6克隆的小鼠肺组织中也检测到更高水平的PVR+巨噬细胞（图E）。
在小鼠肺组织中，NK细胞约占所有表达TIGIT的免疫细胞的70%，并且表现出最高的TIGIT表达水平（图F-G）。虽然CD8+T细胞和调节性T（Treg）细胞也表达TIGIT，但它们的绝对数量和表达强度都显著低于NK细胞（图F-G）。
使用抗体阻断TIGIT信号有效恢复了葡萄糖剥夺的荷瘤小鼠和LC饮食小鼠（图H-I）的NK细胞数量和功能，同时没有改变PVR+巨噬细胞的水平（图J）。这种干预还完全阻止了LC饮食诱导或葡萄糖剥夺诱导的肺转移（图K），并进一步增强了葡萄糖剥夺介导的原发肿瘤消退（图L）。在接受LC饮食的NK细胞缺失小鼠中，TIGIT阻断未能减少肺转移，这突出了NK细胞在介导这一效应中的关键作用（图M）。因此，肺巨噬细胞和NK细胞之间的PVR-TIGIT轴在建立转移前微环境中起着关键作用。
4. 肝癌中葡萄糖剥夺后什么引起了肺巨噬细胞增加驱动NK细胞缺陷？
对人类HCC肿瘤的scRNA-seq数据集分析显示，葡萄糖代谢活性降低的肝癌细胞显著富集了与囊泡介导运输相关的基因（图A）。在HCC样本中，囊泡组织活性（AUCell评分，GO:0016050）与葡萄糖代谢活性（KEGG通路：hsa00010）呈负相关（图B）。空间定位分析进一步证实，具有高囊泡组织活性的肝癌细胞主要分布在葡萄糖代谢活性低的区域（图C-D）。
在葡萄糖饥饿的Hepa1-6细胞培养上清以及关键糖酵解基因敲除的Hepa1-6克隆上清中，检测到细胞外囊泡（也称为外泌体）浓度增加（图E）。同样在携带这些葡萄糖代谢缺陷型Hepa1-6克隆的小鼠或LC饮食的荷瘤小鼠血浆中，也发现外泌体水平升高（图F）。
敲低Rab27a抑制肝癌细胞外泌体分泌，成功逆转了LC饮食诱导的PVR+巨噬细胞序贯激活、NK细胞耗竭和肝癌肺转移（图G-H）。此外，在无瘤小鼠中，静脉注射来自葡萄糖饥饿Hepa1-6细胞的外泌体能有效诱导PVR+巨噬细胞介导的NK细胞耗竭。与此一致的是，与暴露于葡萄糖剥夺Hepa1-6细胞外泌体的巨噬细胞共培养的自体NK细胞，其肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素（IFN）-γ产生显著减少，关键细胞毒性介质表达降低，同时对Hepa1-6细胞的肿瘤杀伤活性减弱。重要的是，这些效应可通过阻断PVR-TIGIT相互作用来逆转。因此，葡萄糖剥夺增加了肝癌细胞分泌的细胞外囊泡数量，改变了其特性，从而塑造了一个支持正常癌细胞转移定植和存活的免疫抑制微环境。
5. 外泌体是如何促进巨噬细胞增加？
5.1 PVR+巨噬细胞是如何形成的？
将巨噬细胞直接暴露于葡萄糖饥饿的Hepa1-6细胞来源的外泌体，能有效诱导这些细胞表达PVR，而用胰蛋白酶预处理外泌体可抑制这一过程（图J），这表明外泌体表面的膜分子对生成PVR+巨噬细胞至关重要。
scRNA-seq数据分析显示，肺组织中的PVR+巨噬细胞表现出与核因子κB（NF-κB）信号密切相关的活化表型（图K）。一致的是，葡萄糖饥饿的Hepa1-6细胞外泌体激活了巨噬细胞中的NF-κB信号，同时伴随NF-κB相关趋化因子和促炎细胞因子上调（图L-M）。相应地，抑制NF-κB信号或中和关键炎症介质如TNF-α和白细胞介素（IL）-1β，能有效阻断此类外泌体介导的PVR+巨噬细胞诱导（图N-O）。抑制NF-κB信号还降低了巨噬细胞中TNF-α和IL-1β的表达（图P-Q）。给LC饮食的荷瘤小鼠注射抗TNF-α或IL-1β抗体，可削弱PVR+巨噬细胞介导的NK细胞耗竭，并减少肝癌肺转移。相比之下，这些外泌体对吞噬受体（Scara1和Scarb1）、抗原呈递分子（H2-Aa/I-A和H2-Eb1/I-E）以及M2型巨噬细胞标志物（Cd206/Mrc1和Arg1）的表达影响甚微（图M）。因此，葡萄糖剥夺的肝癌细胞外泌体通过膜分子触发的NF-κB信号通路，在肺组织中生成PVR+巨噬细胞。
5.2 外泌体膜分子上什么信号触发NF-κB信号通路？
利用ExoCarta数据库筛选出11种参与NF-κB上游信号传导的膜分子（图A）。其中TRAIL和Fas配体（FASLG）被鉴定为能够激活NF-κB的关键配体。通过电子显微镜观察发现，在葡萄糖饥饿条件下培养的Hepa1-6细胞所分泌的外泌体表面TRAIL（而非FASLG）显著增加（图B-C），这一现象在谷氨酰胺饥饿条件下并未出现（图D）。
进一步验证显示，在携带葡萄糖代谢缺陷型Hepa1-6克隆的小鼠以及LC饮食喂养的Hepa1-6荷瘤小鼠血浆外泌体中，TRAIL水平同样升高（图E-F）。值得注意的是，敲低Rab27a（可抑制肝癌细胞外泌体分泌）能够减弱LC饮食诱导的血浆外泌体TRAIL水平升高（图G）。在葡萄糖饥饿条件下，仅肝癌来源的细胞外囊泡（EVs）在同等EV浓度下表现出显著的TRAIL富集，而其他细胞类型（包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞和成纤维细胞）的外泌体中TRAIL含量极低（图H）。值得注意的是，肺组织中的PVR+巨噬细胞相较于PVR-巨噬细胞表现出更高水平的TRAIL受体（TNFRSF10B）表达（图I）。
敲低了肝癌细胞中TRAIL的表达，显著降低了血浆中外泌体TRAIL的水平（图J）。支持这一结果的是，TRAIL敲低还通过抑制PVR+巨噬细胞诱导的NK细胞耗竭，阻止了肺组织转移前微环境的形成（图K-N）。在LC饮食喂养的荷瘤小鼠中，当阻断肺巨噬细胞上的TRAIL受体时，也观察到了类似的结果（图O）。与这些发现一致的是，体外培养的人巨噬细胞暴露于葡萄糖饥饿的肝癌细胞来源的外泌体后，表现出连续的NF-κB激活、炎症细胞因子产生以及PVR表达，而这一过程可通过敲低TRAIL信号来消除。
6. 外泌体TRAIL是如何形成的？
6.1 TRAIL是如何进入外泌体的？
与未经处理的细胞不同，葡萄糖饥饿条件下的Hepa1-6细胞并未表现出TRAIL表达量的增加，但显示出细胞内TRAIL蛋白水平降低，同时伴随外泌体TRAIL的增加（图A-B）。这表明葡萄糖剥夺是主动而非被动地将TRAIL分选进入外泌体。相应地，在葡萄糖饥饿（而非谷氨酰胺饥饿）条件下的Hepa1-6细胞外泌体中，检测到TSG101（而非CD63）选择性增加（图C），这提示存在ESCRT依赖的蛋白质分选机制（分选泛素化蛋白）。与谷氨酰胺饥饿不同，葡萄糖饥饿有效提高了Hepa1-6细胞中泛素化蛋白（包括TRAIL）的水平（图D）。敲低TSG101有效抑制了葡萄糖剥夺介导的外泌体增加，并完全阻断了外泌体TRAIL的生成（图E-F）。免疫共沉淀实验证实TSG101与TRAIL紧密结合（图G）。因此，葡萄糖剥夺通过ESCRT依赖的途径促进肿瘤细胞中外泌体TRAIL的形成。
6.2 葡萄糖剥夺如何启动ESCRT依赖的外泌体TRAIL形成？
通过RNA-seq分析发现葡萄糖饥饿的Hepa1-6细胞中有752个基因表达上调至少2倍。GO注释显示，未折叠蛋白反应（UPR）相关通路是最显著富集的通路（图H），提示葡萄糖剥夺引发了内质网应激。在Hepa1-6细胞中，葡萄糖（而非谷氨酰胺）饥饿选择性激活了内质网应激下游效应分子蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）和需肌醇酶1α（IRE1α），但未激活ATF6（图I），这一现象在人类HCC样本的scRNA-seq数据集分析中得到证实（图J）。
为验证内质网应激是否参与ESCRT依赖的外泌体TRAIL形成，在葡萄糖饥饿的Hepa1-6细胞中使用IRE1α和PERK抑制剂，发现两者均能有效阻断TSG101介导的TRAIL外泌体分选（图K-L）。相反，用内质网应激激动剂衣霉素（Tm）处理未饥饿的Hepa1-6细胞，可显著增强TSG101介导的TRAIL外泌体分选。
此外，HMG-CoA还原酶降解蛋白1（HRD1）被鉴定为内质网应激相关错误折叠蛋白降解的E3连接酶，HRD1在葡萄糖剥夺条件下显著上调（图M），敲低HRD1可有效抑制TRAIL泛素化并阻断ESCRT依赖的外泌体TRAIL释放（图N-O）。免疫沉淀实验显示HRD1选择性增强TRAIL的K63连接型泛素化修饰，这种修饰主要发生在葡萄糖饥饿的肝癌细胞中（图P）。重要的是，K63连接型泛素化主要促进蛋白质转运而非降解。这些发现揭示葡萄糖剥夺通过触发"内质网应激-HRD1-泛素化-ESCRT"轴促进TRAIL相关外泌体形成。值得注意的是，在葡萄糖饥饿条件下，TSG101或HRD1敲低的Hepa1-6细胞所产生的外泌体，丧失了诱导PVR+巨噬细胞介导的NK细胞耗竭及肝癌肺转移的能力。
7. 外泌体TRAIL是否可以作为临床标志物？
研究开发了酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测血浆外泌体TRAIL浓度（图A）。
与上述发现一致，通过FDG-PET成像（图B）、LDH活性检测（图C）以及基于GSVA的RNA-seq数据分析（图D）证实，血浆外泌体TRAIL水平与配对HCC肿瘤组织的葡萄糖代谢活性呈负相关。随后检测了20名健康供体、31名无肺转移HCC患者和37名肺转移HCC患者的血浆外泌体TRAIL水平，与预期一致，肺转移HCC患者血浆外泌体TRAIL水平显著升高（图E）。
以这些数据作为训练队列建立HCC患者肺转移预测模型，结果显示循环外泌体TRAIL能有效区分转移与非转移患者，曲线下面积（AUC）达0.833（图F）。为验证外泌体TRAIL预测肺转移的预后价值，利用92例手术时未见明显转移的HCC患者队列中测试该模型。手术当日采集血液样本，受试者ROC曲线分析显示，外泌体TRAIL在术后第一年预测准确性最高，随时间推移呈现清晰分层：1年AUC值0.824，2年0.768，5年0.674（图G）。值得注意的是，外泌体TRAIL的预测效能显著优于AFP和肿瘤大小，AUC值分别为0.824 vs 0.701和0.633（图H）。这些结果突显外泌体TRAIL作为HCC患者肺转移早期预警标志物以及外泌体TRAIL水平升高成为手术切除患者早期复发的独立预后因素（图I）。
本研究中主要聚焦于肺转移，因为肺是多种肿瘤血行转移最常见的靶器官之一。然而肿瘤细胞通过血流的转移扩散并不局限于肺部。包括骨骼、肝脏和大脑在内的其他器官也常成为肿瘤定植的部位。因此可以推测，低碳水化合物（LC）饮食诱导的肿瘤源性外泌体改变，同样可能影响这些非肺器官中转移前微环境的形成。尽管相关机制可能与肺部观察到的现象具有某些共同的免疫学和分子特征，但它们也可能受到器官特异性免疫微环境和基质相互作用的影响。因此，研究并比较不同靶器官在营养匮乏条件下对外泌体介导的微环境重塑如何响应，或将为转移的器官趋向性提供重要见解，并为开发术后靶向策略以预防转移定植提供理论依据。
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