揭示生物样本在亚微米尺度上的结构和功能组织需要高分辨率成像技术，以提供实时的定量信息。然而，从单次成像中解析和分析未标记的生物结构在亚细胞级别仍然具有挑战性。作者采用了一种新颖的基于横向剪切数字全息显微镜的非相干定量相位成像技术，其剪切距离超过了所用照明的相干区域。这种策略确保了无伪影的高精度和高分辨率定量相位重建。该领域将单次成像的横向剪切数字全息显微镜扩展到非相干照明，从而增加了该方法的时空带宽积。实用的共路径几何还提供了增强的抗振动能力，这对于一致的时间序列测量至关重要。作者团队首先通过多组冷凝器–物镜对来验证该方法的可扩展性和有效性，从而提供更广泛的横向分辨率和视野，确保其在各种显微镜设置下的适用性；然后实验上验证了长期的相位稳定性和前所未有的相位重建精度；最后，使用其技术来研究生物样本，包括面颊细胞、硅藻和酵母细胞，突显其在细胞器层面进行动态无标记分析的潜力。这些结果确立了其方法作为定量相位成像的强大工具，使在广泛的科学应用中进行高精度研究成为可能。
数字全息显微镜(DHM)是一种基于相干性的多功能方法，可以从微观甚至纳米级的不同样本深度中获取详细的定量相位信息。DHM已成为一种最先进的技术，可实现精确、非接触式、非破坏性的样品分析，其应用领域涉及生物医学和材料科学等多个研究领域。它还擅长在极端和复杂条件下捕获数据，例如水下、浑浊或散射、漫反射环境。常见的DHM策略利用由相互相干的物体和参考光场混合形成的干涉图案。记录的图案堆栈经过进一步处理，检索到的复振幅揭示了被研究物体引起的光程差。
大多数DHM方法依赖于时间和空间相干照明，这带来了严重的问题，包括散斑噪声增加、寄生干涉伪影和成像系统分辨率降低。事实上，只有少数单发非相干全息方法可以实现真正的全视场定量相位分析。当将衍射光栅、棱镜或适当的体积衍射光学元件集成到干涉仪的参考臂中时，可以实现来自一个部分相干光源的两个离轴信号和参考波之间的完全时空重叠。这种策略使两个相互倾斜的波的相干平面平行。因此，在整个视场(FoV)中保持均匀干涉。上述技术将单发离轴DHM的应用扩展到非相干照明，从而提高了重建的定量相位图的横向分辨率和均匀性。
常见的双臂干涉仪，如马赫-曾德尔配置，提供不依赖于样品的参考波，但代价是设置复杂性增加，相位稳定性降低而没有外部稳定，并且在特定的干涉设计中成像精度较低。这些限制可能会阻碍DHM在所需的实际应用中的实用性。使用共路径非轴向数字光学相机(DHM)可以实现增强的相位稳定性。从生成参考光束的方法来看，作者将共径模型主要分为点衍射DHM和横向剪切DHM(LSDHM)。点衍射装置利用了FoV的两个完全重叠副本之间的干涉。样本依赖的参考波相关的限制通过对其中一个视场副本进行严格的光谱过滤来解决，这通常是通过精确定位的针孔来实现的。滤波过程允许样本的低空间频率过渡，从而创建一个“干净”的参考波。这种全息方法可以对低吸收率的样品进行成像。这种方法称为衍射相位显微镜，允许在空间非相干和白光照明下进行实验。但是，如果空间滤波不充分，非零空间频率会泄漏到参考场中，导致最终的全息重建缺少相应的非零光谱内容，会出现阴影和光晕伪影。
另一方面，更易于调整的横向剪切方法利用了FoV的两个相互位移（剪切）副本之间的自干扰。该技术可用于相位梯度检索，提供沿剪切方向的波前导数，或用于直接DHM重建。本文集中介绍直接数字全息显微镜(DHM)，提取整个物体的定量相位分布而非相位梯度恢复。事实上，直接全息成像是通过将剪切力增加到超出观察物体的尺寸来实现的，从而产生了简明的直接全息显微镜。特别是在横向剪切DHM(LSDHM)中，第一个FoV副本的空白部分用作第二个副本的参考波，这对于稀疏和有界样本是有利的，是微流体的典型情况。因此，LSDHM提供了定量相位重建，没有阴影和光晕伪影。然而，在这种交叉参考干涉策略中，有限的横向剪切距离限制了应用于全相干或部分相干照明的能力，要求相干区域大于剪切距离。据作者所知，目前没有广泛认可的研究明确展示过一种成功的非相干LSDHM技术，其中剪切距离显著超过相干区域；因此，在常线路径LSDHM中尚未引入空间非相干照明的使用。
在这项工作中，作者提出了一种基于LSDHM的新型非相干定量相位成像技术，其剪切距离超过了所采用照明的相干区域。此设置提供无伪影、高精度和高分辨率的定量相位重建。值得注意的是，这种方法消除了对双臂干涉仪的需求，简化了非相干数字全息显微镜的实现，从而为定量相位成像系统提供了一种高效且易于重新配置的解决方案。实用的共路径几何结构确保了先进的抗振性，这是一致延时测量的关键特性。作者团队通过使用各种高数值孔径冷凝器-物镜对来强调全息显微镜的适应性，提供各种FoV和光学分辨率。此外，通过实验，验证了长期相位稳定性和前所未有的相位重构精度，并以高分辨率对单个细胞进行成像，从而在细胞器水平上提供单次无标记分析。
图1显示了所呈现的LSDHM的简化布局，满足所有剪切距离的要求，超出了相干区域。所有镜头均采用远心配置排列。初始的不连贯照明通过光束偏移器被复制并移位而没有倾斜。随后的高数值孔径样品照明（由透镜和高数值孔径冷凝器组成）将位移的非相干光场重新成像到样品平面中。第一个样品图像出现在显微镜的中间像平面中，由显微镜物镜和镜筒透镜(TL)组成。下列剪切模块提供可调节的横向剪切距离(s′)，该摄像机平面包括衍射光栅(G)和4f光学系统。s′是通过将G轴向偏移远离中间成像平面来设定的。分离隔膜(SD)传输G的第0和第1衍射级，其余的衍射级则被阻塞。插入在SD内部的滤光片分别过滤掉来自零级和一级衍射光的不必要光场，以减少图像平面中的不必要强度偏差，最终的干涉图案由相机记录。
全息性能是在用牙签从口腔内部刮取的颊细胞上进行测试的，细胞在一滴水中稀释，然后夹在显微镜载玻片和盖玻片之间。由传输衍射阶产生的干涉图样出现在图2(c)中，插图显示了显现出的干涉条纹。图2(d)显示了干涉记录的傅里叶谱。重建的幅度显示在图2(e)中，相应的2π模相位图在图2(f)中，两者都显示出明显的复共轭复制品。在作者所提出的设置中，样本平面的横向剪切距离达到100米。此外，背景相位畸变主要由残余倾斜和二次相位组成，通过在测量细胞之前在无样本区域记录的参考干涉图样进行了校正。
作者通过研究多种冷凝器–物镜配置中的样本，验证了该方法的可变性和可扩展性。初始配置后，作者使用20×/0.4冷凝器和20×/0.4显微镜物镜[图3]用于观察来自显微硅藻载玻片的硅藻。当在SD光阑平面[图3(a)]中阻挡第一衍射级时，将直接捕获强度的平方根与重建的幅度[图3(b)]进行比较。重建的相位[图3(c)]包含均质背景和硅藻，呈梳状结构，由大约1 μm远距的尖峰组成。这两个特征在图3(c)中红线所示的横截面图[图3(d)]中清晰可见。重要的是，获得的结果没有任何相位平滑、阈值处理或去噪处理。
此外，作者还使用了一个100×/0.9冷凝透镜–100×/1.4油浸显微镜物镜[图3(e)–3(g)]和一个100×/1.4油浸式冷凝器–100×/1.4油浸显微镜物镜[图3(h)–3(j)]配置，对酵母细胞进行了详细观察。酵母细胞是通过将压缩的新鲜面包酵母在室温下与水和糖混合获得的。将一滴这种混合物夹在两个盖玻片之间并用作样品。在这两种情况下，分别对捕获的强度的平方根[图3(e)和3(h)]与重建的振幅[图3(f)和3(i)]和相应的相图[图3(g)和3(j)]进行了比较，并得出以下结论：在直接图像中观察到的细微结构在重建的振幅中得以保留，同时伴随单个细胞[图3(g)]和两个分裂细胞[图3(j)]的定量相位图。
图4说明了典型于点衍射DHM（特别是衍射相位显微镜）几何配置中样品平面与图像平面之间的关系[图4(a)]。样品平面由一个包含衍射光栅和带有内置空间滤波器的4f光学系统的配置复制。在这里，一个副本保持不变，作为物象波，而第二个副本则经过低通滤波，作为参考波。这种配置允许使用空间相干和宽带光源进行实验，因为两个波的相干平面与光学轴垂直[如图4(a)中的灰色矩形所示]。因此，这些波相互干涉，在整个视场中产生干涉条纹，但仅在信号波与其低通滤波的副本100%空间重叠的情况下，即侧向剪切距离为零(s′=0)时。
在典型的LSDHM配置中[图4(b)]，一份视场(FoV)保持不变，作为物体波，而第二份则偏移并倾斜，且没有任何空间滤波。因此，第一份的无样本区域充当第二份的参考波，反之亦然。两个副本之间的空间点不相关性(s>0)不允许使用此方法进行空间上不相干的照明，因为必须引入显著的横向剪切距离s以避免两个样本图像之间的重叠。此外，干涉平面倾斜之间的不匹配限制了该方法在窄谱照明下的使用，这确保了足够的时间相干性，必要以产生整个视场中的对比干涉条纹。
在图4(c)中出现了类似的情况，其中侧向剪切距离s是由于放置在4f光学系统之前的衍射光栅的轴向位移所导致的。该剪切模块设置的距离s与光栅从显微镜的中间像平面（主像平面）的轴向位移成正比。然而，值得指出的是，与图4(b)中的情况相比，相干平面仍然是平行的。
此外，在图4(c)中，其中有两个平行的相同波长的照明光束在样本平面上以距离d位移。为了说明，图4(d)中将光束标记为红色和蓝色。输出的（红色和蓝色）光场相应地位移了距离d，而横向剪切距离s通常不同(d′≠s′)并且与d无关。尤其是，照明位移d的变化不会影响横向剪切距离s。当d′=s′时，会出现一个有趣的情况。在这种情况下，红色零级衍射光与蓝色照明光束的一级衍射光在时空上重叠。图4(e)中存在这样的预测，其中为了方便起见，部分重叠的光场已被过滤掉。然而，干涉不会出现，除非两束光源自同一非相干光源。
横向剪切数字全息显微镜通过将剪切力增加到超出观察物体的尺寸来实现直接定量相位成像，从而形成适用于紧凑型便携式设备的强大共径成像系统。然而，这些显微镜的成像质量受到空间相干照明的限制，导致斑点相位不均匀，分辨率受空间相干照明的限制。作者的方法克服了所有这些限制，将横向剪切数字全息术的潜力扩展到高精度和高分辨率的实际应用，为材料科学、生物医学等不同领域的实际应用开辟了新途径。
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