一、核心原理与策略选择
逐步稀释原理
通过接种环的连续划线操作，使微生物样本呈梯度稀释，最终获得单个微生物繁殖形成的独立菌落。
划线方法选择
二、标准化操作流程（分区划线法）1. 前期准备
培养基处理：
使用厚度3-5mm的琼脂平板，倒置37℃预烘干1小时（消除冷凝水）。
标记皿底（样本信息、日期、操作者）。
工具灭菌：
接种环火焰灭菌至红热（≥10秒），冷却30秒（触碰空白琼脂验证无气泡）。
2. 四区划线操作
第一区划线：
左手托住培养皿底部，右手持接种环，将培养皿平放在台面，打开皿盖约 1/3（避免杂菌落入），在培养基边缘的左上角区域（占平板面积 1/5-1/4）做连续的平行划线（线条间距 1-2mm），划线时接种环与培养基表面呈 45°角，力度适中（避免划破琼脂）。
第一区划线结束后，将接种环再次灼烧灭菌、冷却。
第二区划线：
转动培养皿约 90°，接种环冷却后，在第一区末端 1-2 条线处开始（确保与第一区有少量交叉，传递部分微生物），向平板另一区域做连续平行划线，线条方向与第一区垂直或倾斜，覆盖平板面积 1/4 左右，避免与第一区大面积重叠。
划线结束后，接种环再次灼烧灭菌、冷却。
第三区划线：
转动培养皿，接种环在第二区末端 1-2 条线处开始，向新区域划线，线条方向与第二区垂直，覆盖平板剩余面积的 1/4，此时微生物已进一步稀释。
划线结束后，接种环灼烧灭菌、冷却。
第四区划线：
转动培养皿，接种环在第三区末端 1-2 条线处开始，向最后剩余区域划线，线条可更密集（因菌量已极少），最终在第四区末端应能形成单菌落。
划线结束后，接种环立即灼烧灭菌（避免残留微生物污染环境），冷却后放回试管架。
关键动作：
每区划线后必须火焰灭菌接种环！
培养皿开盖角度≤45°，火焰旁无菌区操作。
3. 培养与观察
倒置平板，37℃培养18-24小时。
理想结果：第四区可见离散分布的圆形单菌落（直径1-3mm）。
四、进阶技巧
高粘稠样本处理：先用无菌生理盐水稀释后再划线。
苛养菌分离：划线后贴对应抗生素纸片（如分离MRSA用苯唑西林纸片）。
菌落快速筛选：在皿底标记目标菌落位置，便于后续挑取。
五、安全注意事项
生物危害样本需在BSL-2级实验室操作。
废弃平板需121℃高压灭菌30分钟后再处理。
