通过向42只氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉大鼠的脑桥脚被盖（PPT）局部微量注射谷氨酸（10 mM，5-12 nl）进行刺激，我们绘制了该区域的功能性分区图谱。功能响应被分为：（1）呼吸暂停；（2）呼吸急促；（3）高血压；（4）窦性心动过速；（5）颏舌肌肌电图激活；（6）桥脑波激活。研究发现，短潜伏期呼吸暂停主要源自PPT外侧部（邻近胆碱能神经元区域），呼吸急促反应源于PPT腹侧区，高血压反应集中在前内侧PPT腹侧部。刺激内侧PPT最腹侧（与桥脑网状口腔核交界处）可诱发窦性心动过速，而桥脑波激活主要见于PPT背尾侧部。颏舌肌肌电图激活则来自PPT内侧部。本实验结果支持PPT内存在调控呼吸、心血管功能、脑电图和颏舌肌活动的功能分区理论。
一、介绍
脑桥被盖区参与多种状态调节和行为功能。该结构在快速眼动睡眠及其相关现象中起重要作用，包括脑电激活、海马θ节律和桥脑波。将谷氨酸注射至清醒大鼠的该区域可长时间增加快速眼动睡眠与觉醒，而注射卡巴胆碱在猫和大鼠中可持续数日增强快速眼动睡眠。对其损伤或药物阻断会减少觉醒，消除或改变快速眼动睡眠的紧张性与相位性成分表现（包括桥脑波与快速眼动）。该区域还参与运动控制、感觉调制、定向注意、反应时间及学习记忆的调控。
该结构在自主神经调节中可能发挥重要作用。持续电刺激麻醉猫的该区域会引发呼吸抑制，而研究显示将卡巴胆碱注入清醒大鼠的该区域会增加睡眠期呼吸节律紊乱。在麻醉大鼠该区域微量注射谷氨酸会引发呼吸扰动，表现为呼吸急促与呼吸缓慢/呼吸暂停的异常交替。刺激该区域还可诱发以血压升高为特征的心血管反应。
多种证据表明脑桥被盖区神经元可根据功能实现一定程度的解剖分区。例如，其腹前内侧亚区与基底神经节形成双向神经连接，而背尾侧部分与边缘系统腹侧被盖区存在特异性神经通路。前部与后部区域的损伤对大鼠尼古丁诱导的运动行为及自我刺激行为产生相反效应，训练前特异性刺激前部区域可改善后续学习能力。
本实验室研究发现，麻醉大鼠局部注射谷氨酸可诱发呼吸节律失常、脑电图激活、海马θ节律或桥脑波等阶段性事件增强。进一步研究表明，这些现象根据刺激位点存在至少部分可分离性，提示功能拓扑特征。然而，目前尚缺乏对该区域呼吸、心血管及脑电活动的系统性功能图谱研究。本研究旨在通过微量谷氨酸注射技术，构建脑桥被盖区内呼吸、心血管与脑电现象的功能图谱。
二、方法
实验使用42只自主呼吸的雄性成年斯普拉格-杜利大鼠进行，体重200-300克，饲养于12小时光暗循环环境，室温25℃并提供自由摄食饮水。严格按照《实验动物护理和使用指南》规定的原则进行动物实验。
01.手术准备
通过腹腔注射氯胺酮(80 mg/kg)和甲苯噻嗪(5 mg/kg)的混合液对大鼠实施麻醉。达到外科麻醉平面后，将大鼠固定于立体定位仪。通过血压、心率和反射（角膜反射与足趾夹捏反射）监测麻醉深度，必要时追加氯胺酮(40 mg/kg)/甲苯噻嗪(2.5 mg/kg)维持麻醉，每次追加后至少间隔15分钟再进行操作。
记录双侧脑电图的螺钉电极分别植入额叶皮层（前囟前2.5 mm，中线旁开2 mm，脑表面下1 mm）和顶叶皮层（前囟后2.5 mm，中线旁开2 mm，脑表面下1 mm），以鼻根部的螺钉作为参考电极。采用特氟龙涂层不锈钢双绞线电极（裸露尖端1 mm，极间距1 mm）立体定位植入对侧桥被盖核记录脑桥电图（前囟后7.8 mm，中线旁开1.8 mm，脑表面下7 mm）。颏舌肌肌电图通过双侧植入舌系带旁1-2 mm的特氟龙涂层电极（裸露尖端2 mm）获取。心电图经腋下和腹股沟区皮下针电极记录。经股动脉置管连接压力传感器监测血压。
通过单侧颅骨钻孔术暴露对侧桥脑外侧部，小心移除硬脑膜。采用带芯标准玻璃管（1 mm×0.25 mm，AM Systems）配合垂直拉制仪制备三腔微管，最终尖端直径10-20 μm。使用毫秒脉冲压力注射器（MPPI-2）分别注入谷氨酸钠（10 mM溶于0.2 M PBS）、0.2 M PBS或油红O染色剂（7 mg/ml乙醇溶液）用于后续注射位点组织学验证。
该注射系统配有背压单元以防止注射间隙发生液体回流。典型工作压力约70 psi，背压维持约0.1 psi。
02.记录流程
实验全程进行10通道同步记录，包括：左右额叶单极皮层脑电、左右顶叶单极皮层脑电、桥脑双极脑电、颏舌肌肌电、胸廓压电呼吸传感器信号、心电、动脉血压以及压力注射器提供的触发标记信号。
所有模拟信号经放大滤波处理（脑电和血压采用1-20 Hz带通，肌电和心电1-100 Hz，呼吸信号1-10 Hz；CyberAmp 380放大器）后，以200 Hz采样频率进行数字化存储（SciWorks数据采集系统）。正式记录前先采集10分钟基线数据，每次注射间隔至少5分钟。
03.实验方案
微管经立体定位系统引导至目标区域背侧缘起始位点，以100 μm步距向腹侧推进。每个注射位点注入5-12 nl谷氨酸溶液，使用配备标定目镜的体视显微镜直接观测液面位移进行体积计量。谷氨酸剂量参数依据研究人员的早期研究成果选定，该浓度与体积组合可有效引发特征性呼吸反应。相关研究显示，药物在35秒内的有效扩散半径约150 μm。
每次注射前后同步记录脑电（皮层与桥脑）、肌电、血压及呼吸信号。当任一参数出现肉眼可见的显著扰动即判定为有效位点，此时需间隔至少5分钟方可继续推进微管。所有实验对象在有效位点均接受两次重复注射以验证反应持续性和可重复性。每个有效位点均设置PBS注射作为伪刺激对照，PBS注射随机安排在两次谷氨酸注射前后。实验结果显示重复谷氨酸注射均可复现初始反应，而所有PBS注射均无此效应。尽管油红O染料使用存在微量乙醇渗漏的可能性，但良好的反应重复性表明该因素不影响实验结果解读。
有效位点注射油性O红染剂进行组织学验证。部分实验中在实验结束时使用生物素化葡聚糖胺标记反应点。通过离子电渗法递送BDA。
研究人员在设计实验时改变了PPT区域内的初始靶点位置，以实现对PPT区域解剖范围内响应的均衡采样。
04.数据处理
使用本实验室开发的软件进行呼吸模式分析。采用自动化自适应阈值算法检测和量化呼吸周期的吸气相与呼气相，提供每次呼吸的吸气时长、呼气时长和总时长。呼吸暂停定义为持续时间超过前10次呼吸平均值50%以上的单次呼吸。心动过速需持续至少3次呼吸，通过视觉评估确定。高血压表现为短暂血压升高后恢复基线。窦性心动过速经视觉评估且最少持续3个心动周期。颏舌肌肌电图激活情况对照前10秒基线进行视觉评估。根据以下标准从脑桥脑电图轨迹目测评估p波：（1）整个记录中极性一致的主要偏转；（2）波形持续时间50-150毫秒；（3）显著区别于背景的大振幅。
05.组织学
实验结束时，对大鼠进行深度麻醉（必要时追加40/2.5 mg/kg氯胺酮/甲苯噻嗪混合剂量），并行心内灌注。灌注程序以40 ml/min流速进行血管冲洗（约1分钟），使用0.9%生理盐水直至肝脏组织洁净。随后依次灌注4%多聚甲醛溶液（300 ml按40 ml/min继而30 ml/min流速）以及磷酸盐缓冲液配制的10%蔗糖溶液（30 ml/min流速）。全脑完整摘除后清除脑膜与血管，并浸入4%多聚甲醛溶液过夜。脑组织随后在30%蔗糖溶液中浸泡数日，使用冰冻切片机沿横断面切制40 μm厚切片。为确定微量注射位点与PPT区胆碱能神经元的位置关系，切片经含2 mg/ml β-NADPH与1 mg/ml硝基蓝四氮唑的混合液孵育15分钟，进行NADPH黄递酶染色处理。风干后的载玻片经二甲苯透明处理，使用Permaslip封片。
三、结果
在总计42只大鼠中进行102次谷氨酸注射后观察到了功能反应。基于对数据的初步探索性分析，这些反应被分类为：(1) 呼吸暂停（22只大鼠共49次注射）；(2) 呼吸急促（7只大鼠共8次注射）；(3) 高血压（5只大鼠共10次注射）；(4) 心电图窦性心动过速（2只大鼠共5次注射）；(5) 颏舌肌肌电激活（6只大鼠共14次注射）；(6) P波异常（5只大鼠共6次注射）（图1A和B）。该分类系统涵盖了超过90%的观测反应。然而，在10只大鼠中观察到复合反应，包括呼吸暂停合并肌电激活（2例）、呼吸暂停合并高血压（4例）、呼吸急促合并高血压（2例）、高血压合并肌电激活（1例）、以及呼吸急促合并高血压与P波异常（1例）。
通过沿背腹侧轨道推进微量移液管，可在同一轨道内诱发不同模式或相同模式不同潜伏期的反应。如图1B所示，纳入分析的各类反应具有不同潜伏期，但均发生在谷氨酸注射后5-35秒内。为绘制"反应区域"的功能图谱，我们采用各实验轨道中对应模式最短潜伏期反应所关联的移液管定位点。谷氨酸引发的多模态反应多发生在单一模态反应区之间的"过渡区域"。
图1. PPT谷氨酸微刺激诱发反应：(A) 不同PPT注射位点的显微照片图示与(B)对应位点谷氨酸微量注射的生理反应解耦 40微米脑切片(A)经NADPH-黄递酶染色显示胆碱能神经元（深色反应产物）。图B展示了六类生理反应：(1) 呼吸暂停；(2) 呼吸急促；(3) 高血压（HTN）；(4) 窦性心动过速；(5) 颏舌肌肌电激活；(6) P波异常。各曲线图中垂直标记线（10秒处）标示注射时间点，水平细线标记反应区间。呼吸曲线中基线向下偏转代表吸气过程。缩写说明：呼吸（Resp）；血压（BP）；心电图（ECG）；桥脑脑电图（EEG）；颏舌肌肌电图（EMG）。
图2将所有42次实验中不同模态的短潜伏期反应，映射到PPT区域前后轴向间隔400微米的横断面脑图谱上。反应定位点与NADPH-黄递酶(+)胆碱能细胞的位置关系通过背景填充圆点表示。不同模态反应使用彩色符号标注，并映射到与移液管尖端对应的解剖学40微米组织切片最近的400微米平面。注射位点周围的半透明圆圈表示研究人员通过理论预测得出的谷氨酸扩散距离（直径约300微米），具体细节参见第4部分。
图2. PPT不同位点谷氨酸微量注射诱发反应示意图。注射位点的解剖定位具有±40微米的前后轴向分辨率（等同于切片厚度）。为提升示意图清晰度，本研究将多组实验中经组织学验证的移液管定位点投射到对应的400微米坐标区间（距前囟6.8–7.2、7.2–7.6、7.6–8和8–8.4毫米）进行整合展示。注射位点叠加于标有PPT区NADPH-黄递酶阳性胆碱能神经元分布的背景图上，六类反应类型通过色标系统区分。圆形标记直径表示谷氨酸短时扩散范围的理论估值（直径约300微米，详见图注），空心圆代表未诱发反应的注射位点（内部数字表示该位点叠加的无反应注射次数），实心黑点指示胆碱能神经元位置。缩写说明：被盖后红核区（RRF）；桥脑嘴侧网状核（PnO）；小脑上脚（scp）；楔形核（CnFV）；微细胞被盖核（MiTg）；红核脊髓束（rs）。
01.呼吸暂停
如图2所示，谷氨酸微量注射引发的呼吸暂停反应分布于PPT区域前后轴全程（距前囟6.8-8.4毫米）。在PPT最前部（距前囟6.8-7.2毫米），呼吸暂停由背外侧与胆碱能神经元相关的区域引发；在PPT最后部（距前囟8.0-8.4毫米），呼吸暂停位点主要集中于腹外侧区域。在此前后极之间的中间区域，呼吸暂停位点沿PPT的中间外侧和背腹轴分布，但仍以腹外侧区域为主。所有呼吸暂停位点均紧邻PPT区域内的胆碱能细胞分布区。
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在PPT前部，潜伏期＞35秒的延迟性呼吸暂停位点分布在短潜伏期呼吸暂停位点背侧300微米范围内；在PPT后部则分布于腹侧300微米范围内；整个PPT区域中还可见分布于中间或外侧100微米范围内的延迟性呼吸暂停位点。五个实验的基础记录中观察到自发性呼吸暂停，但如表1所示，这些自发性呼吸暂停在基线期5分钟内仅偶发一次，且持续时间短于谷氨酸诱发的呼吸暂停，故无法解释PPT诱发的呼吸暂停现象。
02.呼吸急促
呼吸急促（图1B）由PPT腹外侧边缘的多个位点诱发，这些位点分布于距前囟7.6-8毫米的腹外侧区及距前囟8-8.4毫米的PPT腹侧部（图2）。谷氨酸注射后0-15秒内即出现呼吸急促反应，通常持续时间不超过35秒。两例实验中该反应伴随短暂高血压，且个别注射后呼吸急促与高血压可先后独立出现。
03.心血管功能紊乱
谷氨酸注射后短潜伏期高血压（HTN）反应主要产生于PPT腹侧半区（前极区域除外），持续时间约30秒。在10例观察到的HTN反应中，多数未伴随呼吸模式改变。在PPT与桥脑嘴侧核交界处的2个位点观察到短暂窦性心动过速（图2）。
04.颏舌肌肌电活动
颏舌肌肌电激活由PPT中间后部区域（距前囟7.6-8毫米）诱发，该区域环绕小脑上脚分布（图2）。肌电反应既可伴随呼吸反应出现（2例），亦可独立诱发（4例）（图1B）。
05.P波异常
谷氨酸注射于PPT背尾侧部时，可于对侧PPT记录到P波异常（图2）。该反应表现为持续1-3秒、波幅同向的重复单相波簇，簇内波动频率5-6赫兹（图1B）。与我们前期的研究结果一致，单纯诱发P波的谷氨酸注射位点均位于呼吸反应诱发位点的背侧。在PPT后部2例实验中，同一注射位点可先后诱发呼吸反应与P波异常，但呼吸反应始终早于P波出现。
四、讨论
本研究通过谷氨酸微量注射建立了PPT刺激引发呼吸、心血管、肌电及脑电反应的系统性功能地形学框架。研究结果表明，局部PPT刺激引发的各类功能反应在解剖学上可定位至部分独立的亚区。值得关注的是，本研究表征的大部分反应均由富含胆碱能神经元的PPT区域诱发。由于PPT区域参与多种整合功能，其局部谷氨酸能刺激可诱发多种自主神经与电生理反应实属合理，但各"反应区"呈现出独特的空间组织特性。
实验数据表明，微量移液管推进100微米即可能使无反应位点转化为可视反应位点，或导致反应潜伏期缩短/延长。本研究构建的"反应区"功能图谱以各轨道中潜伏期最短（＜35秒）反应的定位点为基础，该观察结果进一步印证了"反应区"分域化的生物学合理性。
研究人员通过数学模型推算出，注射后30秒内，距注射位点300微米处的药物（谷氨酸）浓度最高不超过移液管尖端浓度的20%。另有研究表明，在自由活动大鼠中使用大剂量注射（100纳升）时，PPT区诱发快速眼动睡眠增加的谷氨酸最低浓度为2毫摩尔，而诱发觉醒状态增强则需超过5毫摩尔谷氨酸。本研究采用10毫摩尔谷氨酸浓度，提示距移液管尖端300微米半径范围内药物浓度梯度可有效覆盖功能激活所需的阈值水平。
由此可见，谷氨酸扩散至距注射位点约300微米范围内的活性区域可能是导致观察到的反应潜伏期变异的重要因素。这一机制将本研究的反应定位空间分辨率限制在±150微米范围内。因此，采用100微米间距的连续注射方案实质上创建了具有部分重叠的谷氨酸刺激区。在此背景下，微量移液管推进100微米即可能在过渡区域引发复合反应的现象具有合理性。
实验观察到呼吸暂停合并高血压（4例）、呼吸暂停合并肌电激活（2例）及呼吸急促合并高血压（2例）等复合反应模式。结合前述机制，我们推测此类复合反应可能源于单次注射谷氨酸的扩散作用同时影响毗邻的不同功能亚区。
值得关注的是，神经元树突分支的广域分布可能影响反应定位与潜伏期特征。研究表明，PPT神经元树突可延伸至距胞体500微米的范围。这种现象可能导致基于注射位点的反应区发生定位扩展甚至位移。但需特别指出，PPT神经元树突主要延伸至邻近感觉传导通路，且其谷氨酸受体主要富集于胞体区域。
本研究所揭示的PPT功能拓扑结构符合其生物学特性。作为桥脑的重要组成部分，PPT不仅参与行为状态调节，更在感觉与自主神经功能整合中发挥关键作用。就心肺功能调控而言，PPT接收来自延髓孤束核（NTS）的重要输入信号——后者本身具有显著的亚核功能分化特征。早期研究证实，NTS与桥脑臂旁核的连结具有高度功能特异性。本研究发现提示此类功能特异性连结同样可能存在于PPT系统，但其具体解剖学基础尚待后续研究阐明。
几乎所有谷氨酸诱导反应均发生于胆碱能神经元分布位点。PPT区胆碱能神经元的空间分布具有亚区化特征：后部高密度区（PPTc，密部）与前部低密度区（PPTd，散部）存在显著差异。研究表明，大鼠PPT区胆碱能神经元在细胞化学特征和神经连结模式上均不同于其共存非胆碱能细胞。PPTc区胆碱能神经元在细胞结构与树突分支特征上明显区别于PPTd区，前者胞体更小且树突分支更短而稀疏。研究人员指出，这种解剖学差异可解释PPTc区更易引发局部反应的现象，并为不同反应潜伏期的产生提供结构基础。
尽管本研究数据尚不能直接阐释PPT激活调控呼吸、心血管及脑电活动的具体神经通路，但既往神经解剖与生理学研究可提供重要线索。PPTc区是延髓头端腹外侧区（RVLM）心肺调控中枢的主要胆碱能输入源，其胆碱能轴突在终末核团内形成广泛分支。通路示踪研究证实，胆碱乙酰转移酶阳性神经元直接支配RVLM的血压调节区域。研究发现，PPT区双侧注射荷包牡丹碱或兴奋性dl-同型半胱氨酸可引发血压升高及压力反射改变，提示本研究中谷氨酸注射诱发的心肺反应可能源于PPT至RVLM的单突触投射激活，但不排除多突触通路的参与。
值得关注的是，PPT与臂旁核复合体存在双向神经连结，后者联合柯立克核共同调控呼吸相位切换。内侧臂旁核或柯立克核激活可诱导呼气促进与呼吸暂停，而外侧臂旁核刺激则引发呼吸急促。由此推测，PPT刺激可能通过激活内侧臂旁核神经元介导呼吸暂停，而外侧臂旁核激活导致呼吸急促。当然，这些机制的最终验证及多突触通路的具体贡献尚待后续研究解析。
本研究发现特定PPT注射位点的神经化学兴奋可激活颏舌肌肌电活动。研究显示，PPT密部特定区域的胆碱能神经元向舌下神经运动核（Mo12）发出双侧投射，这些投射可能通过兴奋与抑制双重调节机制影响舌下神经运动神经元活性。
P波异常信号被记录于PPT中后部区域，该定位点位于呼吸效应区背侧。药理学与生理学研究证实胆碱能神经元在P波产生与传导中起核心作用。研究显示，不同剂量谷氨酸对PPT胆碱能细胞的作用可诱发快速眼动睡眠与P波或觉醒状态，这为本研究中谷氨酸激活胆碱能神经元诱发P波的现象提供了解释依据。值得注意的是，尽管实验动物采用具有NMDA受体拮抗作用的氯胺酮进行麻醉，但局部微量谷氨酸注射仍可有效诱发P波——这与我们前期研究及其他研究结果一致。系统性氯胺酮麻醉虽不阻碍P波表达，但将其直接注射至PPT则完全阻断后续谷氨酸诱导的P波反应，提示PPT区NMDA受体可能在P波诱发过程中起关键调控作用。
P波的产生涉及多种神经元类型协同作用，其中爆发型神经元起核心作用。虽然NMDA受体参与爆发模式的形成，但AMPA受体、代谢型谷氨酸受体及GABA受体同样对P波的产生发挥调控作用。如前所述，戊巴比妥麻醉状态下PPT谷氨酸注射无法诱发P波现象。
本研究发现，PPT区谷氨酸刺激可引发呼吸、心功能、血管张力、上气道活动及脑电活动的多维度功能响应，充分揭示该区域的功能异质性。这些发现提示PPT在调节状态依赖性自主神经功能中具有广泛作用。值得注意的是，多数表征反应均源于胆碱能神经元富集区，但阐明相关突触调控机制与解剖学通路仍需进一步研究。
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