（来源：昭衍JOINN）
转自：昭衍JOINN
摘要
rasH2-Tg 小鼠是当前转基因替代模型中应用最广泛的短期致癌性试验模型小鼠，对遗传阳性致癌物和非遗传阳性致癌物均敏感，且自发肿瘤率较低。目前国内外相关指导原则还没有针对该转基因小鼠致癌性试验的详细设计要求，本文通过汇总并分析了 2013—2022 年在美国获批上市且采用该转基因小鼠进行的 51 个新药的致癌性试验申报资料，并结合实际工作经验对试验设计要点进行整理论述，为国内新药致癌性试验的开展提供参考。
关键词
致癌性试验；rasH2-Tg 小鼠；替代小鼠模型
致癌性试验转基因替代模型（alternative model）是指非临床研究中用于短期或中期体内致癌性试验，能够提供致癌性终点的转基因动物。1997 年发布的人用药品注册技术要求国际协调会（The International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）S1B[1] 指导原则中提及的转基因小鼠模型包括p53 ＋ / - 缺失模型、TgAC 模型、rasH2-Tg 模型、XPA 缺失模型等，同年，国际生命科学学会（International Life and Sciernces institute，ILSI）和健康与环境科学学会（Health and Environment Science Institute，HESI） 联合发起了一项关于以上替代模型的验证性研究[2]。经比较，rasH2-Tg 模型表现出对人专属致癌物的高敏感性，试验数据重复性高、稳定性好，优于其他模型，目前已被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）、中国国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）、欧洲专利药品委员会（Committee for Proprietary Medicinal Products，CPMP）、日本厚生劳动省（the Ministry of Health，Labor，and Welfare，MHLW）等认可，成为最常用的短期致癌性试验替代模型[3]。
在2022 年公布的ICHS1B（R1）指导原则中，该小鼠名称为 rasH2-Tg 小鼠，日本实验动物中央研究所（Central Institute for Experimental Animals，CIEA）的官网名称为CByB6F1-Tg（HRAS）2Jic mice。该小鼠是由嵌入人源c-ha-ras 三联基因的 C57BL6/J 小鼠与 BALB/C 小鼠杂交而来[4]，得到的子代中杂合子为含转入基因的 rasH2-Tg（transgenic type，rasH2-tg 型）小鼠，纯合子为不含转入基因的Non-rasH2-Tg（wild type，rasH2-wt型）。虽然监管机构的技术指南或相关文献中有关于该模型的说明，但除了在 ICHS1B（R1）[5] 中有关于高剂量选择的意见外，其余指南均未提出具体的试验设计指导，这给创新药物非临床致癌性试验设计带来了困难。
目前国内在长周期用药研发方面正处于上升期，致癌性试验开展还不多，良好实验室规（GLP）条件下开展非临床rasH2-Tg 小鼠致癌性试验的经验更为稀缺，虽然国内已有少数实验室具有开展该类试验的经验，但是普遍来看国内对短期致癌性试验的认识不足。因此，总结 rasH2-Tg 小鼠26 周致癌性试验设计要点十分重要。
在 2013—2022 年， 美国 FDA 的药品审评中 心（Center for Drug Evaluation and Research，CDER）审批通过了 428 项新药上市，其中有 51 项新药进行了 rasH2-Tg 小鼠 26 周致癌性试验，51 项新药药物基本信息见表1。通过对其公开资料的分析，本文从剂量探索试验的设置、高剂量组的剂量选择依据与再评估、rasH2-Tg 小鼠起始给药周龄、阳性对照组的设置和检测指标设置几方面浅谈rasH2-Tg 小鼠短期致癌性试验设计的基本要点。
表1 2013—2022 年 FDA/CDER 审批通过的进行 rasH2-Tg
小鼠致癌性试验的药物基本信息
Tab1 Information of drugs approved by FDA/CDER
in 2013 to 2022
1.试验设计要点
1.1
剂量探索试验的设置
剂量探索试验（dose-range finding，DRF）是指长周期试验前的先行试验，通过进行DRF暴露药物毒性靶点，寻找最佳给药剂量和间隔，估算毒性代谢动力学的趋势和毒性反应发生频率[6]。使用转基因小鼠开展26 周致癌性试验前，开展 DRF 是十分必要的：一方面由于药物在rasH2-Tg 小鼠体内的毒性反应尚不明确，前期试验动物种属多为大鼠和犬，且常用小鼠种系ICR小鼠、C57BL6/J 小鼠与 rasH2-Tg 小鼠的代谢相关性也有待进一步研究；另一方面由于该转基因小鼠致癌性试验的周期长、使用的动物数多，成本高，因此进行DRF 显得尤为重要。
表1的 51 项药物中，31 项新药的 DRF 给药周期都在4 周及以上（其余20 项未显示），长于4 周的试验周期是由于药物临床拟用间隔较长或需前期剂量爬坡建立动物耐受。致癌试验的 DRF 试验可参考正式的重复给药毒性试验来设计；也可在 DRF 试验开展前进行更短周期的预试验，以探索DRF 的剂量，预试验周期在一周或两周。
与正式试验主研究组使用 rasH2-Tg 小鼠不同，DRF 使用的动物为 rasH2-wt 型小鼠，研究显示 rasH2-wt 型小鼠与rasH2-Tg 型小鼠在生化指标、器官重量和药物代谢上几乎没有差别[7]。在 51 项新药的申报资料中，设有rasH2-Tg 小鼠对照组的 DRF 试验结果显示：rasH2-wt 型小鼠与 rasH2-Tg 型小鼠在药物代谢和一般毒性反应上没有显著性差别，由此认为使用 rasH2-wt 小鼠预测正式试验是可行的。DRF 试验结果可为正式致癌性试验高剂量的选择提供依据，但能否以 rasH2-wt 小鼠的体重变化作为判定条件还存在一些争议[8]：一方面，该小鼠多为进口所得，远途长时间运输后，在 4 周的试验周期内有较长的适应期或应激波动，观察到的体重改变不一定是药物毒性所致；另一方面，由于 rasH2-wt 小鼠较同窝 rasH2-Tg 小鼠平均体重略大[7，9]，仅体重指标不能完全代表正式致癌性试验中的 rasH2-Tg 小鼠；此外，一些有减重效果的药物（如降糖药、减脂药）在高剂量下有放大的药效作用，药效引起的 DRF 体重变化被误认为是毒性反应会导致高剂量选择偏低而不能达到充分暴露。基于以上，以 DRF 试验动物体重改变作为高剂量判定依据时还需综合其他指标或前期试验毒性反应结果。此外，毒性代谢动力学分析在 DRF 中十分重要，供试品原药和/ 或其代谢物在体内的暴露量决定了 rasH2-Tg 正式试验的剂量。
1.2
高剂量组的剂量选择依据与再评估
致癌性试验高剂量的选择应该在指导原则的要求下进行综合考虑。ICHS1C（R2）[10] 中关于致癌性试验高剂量的选择依据包括：基于毒性改变，以死亡率、临床症状、体重变化或体重增长量的变化及组织病理学异常为参照设置的最大耐受剂量（maximum tolerated dose，MTD）；基于血液中药物暴露倍数，50 倍血浆暴露量比值（啮齿动物；人）作为参考依据的药代动力学指标；基于生物利用度的吸收饱和量；药效学指标；药物治疗窗较宽时使用的最大可行剂量（maximum feasible dose，MFD）和动物实验限度剂量。此外，一些 rasH2-Tg 小鼠致癌性试验以供试品致死剂量的 1/3 作为试验的高剂量，这一选择也受到监管机构的认可。所有的选择依据都体现了“充分暴露”这一原则，但由DRF 试验结果得到的 MTD 作为首选早已达成科学共识，FDA 毒理学指南Redbook 2000[11] 中推荐MTD 作为高剂量的选择依据，经济合作与发展组织（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）致癌性指导文件Test Guide 451（TG451）[12] 中要求选择能引起如抑制体重增加（与阴性对照组相比约10%）等不影响动物预期寿命的毒性反应最高剂量水平，这与 MTD 的设定条件一致[12]。51 项新药中有 27 项明确选择 MTD 作为 rasH2-Tg 小鼠 26 周致癌性试验高剂量，有 5 项注明参考 MFD 作为高剂量（其余 19 项药物选择指标在申报资料中未见明确信息），其他依据（基于血液中药物暴露倍数，50 倍血浆暴露量比值，基于生物利用度的吸收饱和量，药效学指标）在剂量选择中也具有一定的参考价值。
致癌性试验的终点是指与供试品相关的肿瘤性病变，而试验中的一般毒性反应体现了致癌性试验的暴露有效性。为验证致癌性试验设计的科学性和试验数据有效性，研究人员应在致癌性试验结束时，通过分析包括死亡率、临床症状、体重变化、非肿瘤性病变和血药浓度在内的试验结果再评估剂量设计。
1.2.1 死亡率
致癌性试验中的死亡率指发现非预期死亡和濒死安乐死的动物数量占比。我们认为高剂量组动物死亡率的轻微上升可以看作是剂量达到了充分暴露这一要求的表现，但高剂量组动物死亡率过高时，不仅要评估其对数据统计的影响，而且要考虑过高的剂量是否会造成假阳性率升高而影响结果判断。
1.2.2 临床症状
药物的一般毒性反应靶点在重复给药毒性试验中已有研究，出现一般毒性反应症状是体内暴露量达到毒性剂量的直接体现，在致癌性研究中，需要区分实验系统出现的异常临床改变是由供试品毒性反应引起还是由肿瘤继发性改变引起，或是否属于偶发症状。在致癌性试验中首次发现的异常临床改变应给予足够的重视，必要时需针对该症状开展追加调查。
1.2.3 体重变化
体重是实验动物生长状况的综合体现，体重的异常包括体重降低或体重增长量的降低，过低的体重会影响动物正常寿命，这是剂量设置过高的体现。Tenapanor（NDA 编号211801）[13] 的rasH2-Tg 小鼠 26 周致癌性试验中高剂量组由于雄性动物体重与阴性对照组相比降低超过40%，预测继续给药会导致高剂量组雄性动物大量死亡，因此对高剂量雄性动物进行剂量调整，在第 99 日由原来的剂量 165 mg/（kg·d）调整到了 110 mg/（kg·d）。
1.2.4 非肿瘤性病变
在 51 项新药中常见的与供试品相关的非肿瘤性病变有肝细胞肥大、空泡化、坏死以及脾脏重量增加或降低等，高剂量组这些轻微到轻度的异常足以证明 MTD 选择合理有效。研究人员在评估非肿瘤性病变时，建议从以下几个方面考虑：
① 是否属于 rasH2-Tg 小鼠背景性病变；
② 是否已在本品的其他一般毒理学试验中有相关发现；
③ 是否属于肿瘤继发病变；
④ 是否会对临床试验产生影响。
1.2.5 血药浓度
在ICHS1C 中并未对转基因小鼠的体内暴露量倍数给出建议，仅是要求两年致癌性试验的暴露倍数不少于 25 倍。在转基因小鼠致癌性试验中，若以上毒性反应指标均无异常，可结合毒性代谢动力学数据或组织分布结果考察代谢和体内暴露以评价剂量水平合理性。rasH2-Tg 小鼠 26 周致癌性试验伴随进行毒性代谢动力学试验的目的一为得到GLP 条件下药物代谢趋势，二为确认MTD剂量下动物的体内暴露，ICHS1B（R1）[5] 中认为rasH2-Tg 小鼠给予高剂量时体内暴露量达到 50 倍人的血浆暴露比值符合充分暴露。
1.3
rasH2-Tg小鼠起始给药周龄
FDA、OECD、美国国家环境保护局（U.S.Environmental Protection Agency，EPA）等机构相关指导文件均建议啮齿类动物起始给药周龄在 8 周龄及以前，并遵循离乳后经检疫或适应期后尽早开始的原则[11-14]。小鼠 6～8 周龄已达性成熟期，器官发育成熟，生理生化指标稳定。转基因小鼠致癌性试验动物起始给药周龄受到离乳后基因型检测、国际运输、出入境检疫、rasH2-Tg 小鼠自发肿瘤等多重制约：一方面，小鼠出生后 20 ～ 21 d 离乳，之后通过RT-PCR、Northern 杂交、Western blot 及免疫组化等方法检测人源ras 基因表达[15]，确定转基因座位与标准遗传概貌完全一致[16]，区分杂合子 rasH2-Tg 小鼠和纯合子rasH2-wt 小鼠，长途运输后进入机构通过检疫期并适应环境。由于长距离运输后动物容易应激，建议观察和环境适应时间在 1～2 周；另一方面，rasH2-Tg 小鼠在 34 周龄之后一些自发肿瘤发生率升高，影响试验结果的判断[17]。小鼠自发肿瘤主要与周龄有关，周龄越大，自发肿瘤发生率越高。rasH2-Tg 小鼠致癌性试验给药周期长达 26 周，由于前后限制因素，给药起始周龄建议选择在 8 周龄及之前。
1.4
阳性对照组的设置
小的基因群体中由于动物生育数量不同导致基因型频率波动的现象称为遗传漂变（geneticdrift）[18]。转基因小鼠需要同时关注遗传漂变和
转入的基因功能是否丧失，因此有必要设置阳性对照组以帮助判断实验体系是否满足科学性。致癌性试验的阳性对照组试剂应选择具有明确致癌效应的遗传阳性物。已有研究中使用同时对人和啮齿类动物有致癌作用的 N- 甲基-N- 亚硝基脲（MNU）和尿烷建立啮齿类动物胃癌、乳腺癌、前列腺癌等模型[19-20]。MNU单次腹腔注射剂量 75 mg/（kg·d）即可引起动物患肿瘤概率升高，诱发肿瘤，以恶性淋巴瘤、胃乳头状瘤较多；尿烷给药剂量一般选择 1000 mg/（kg·d），隔日给药一次，共腹腔注射 3 次，诱发上皮异常增生和腺瘤的概率较大[20]。51 项新药 26 周致癌性试验结束时，阳性对照组动物死亡率最高可达100%；注明阳性对照品选择的共44 项，其中 29 项选择MNU，15 项选择尿烷；阳性对照组的动物数量在每种性别10 ～ 25 只，其中每种性别 10 只占46%，15 只占31%，其他占23%。
1.5
检测指标设置
致癌性试验除了常规检查指标，如一般临床观察、详细临床观察、体重、摄食量等项目外，还要有针对肿瘤的触诊检查，以及针对不同的供试品特性设置的非常规指标，如激素水平检测、免疫原性等，帮助评估剂量水平合理性[21]。血涂片是检查血液细胞形态学的样本，rasH2-Tg 小鼠致癌性试验需制备血涂片，可在经组织病理学评估有造血系统肿瘤的情况下进行辅助诊断[22]。
检测指标中组织病理学死亡原因分析是进行肿瘤统计学检测的前提，为帮助解释死亡原因，致癌性试验组织学检查部位要求详尽且有代表性[23]。致癌性试验使用的动物数多，镜下检查范围广，因此病理检查的工作量大、时间久，而致癌性试验要求在上市前完成，关注度高，研究压力大，取材检查部位过多会增加技术难度、拖延试验进度[24]。2003 年美国毒理学会（STP）[23]给FDA 关于致癌性试验的病理检查清单中建议在欧洲和日本监管机构检查部位的基础上删去如咽、喉、视神经、输卵管、输尿管、鼻腔、凝固腺等部位，理由是这些脏器极少见供试品致癌相关性、不具有所在生理系统代表性或病发即可见于临床观察等。哈氏腺、前胃、Zymbal’s 腺等是大小鼠特有的解剖学结构，与人体安全学的相关性有待研究[25]。FDA[11]、OECD[12]和CDE[26] 建议取材部位和 STP 建议取材清单见表2。
表 2 FDA、OECD、CDE的指导原则关于病理检查部位的建议及STP推荐病理检查部位清单
Tab2 Recommended list for histopathologic examination in FDA guidelines，OECD test guidelines，CDE guidelines and STP proposal
组织样本的病理学评估是致癌性试验的关键部分，包括专题病理学家的诊断结果和同行评议病理学家的评审结果。专题病理学家诊断致癌性试验中动物组织或器官的异常改变并出具病理学报告，具有同行评议资格的病理学家进行同期或回顾性病理学同行评议（pathology peer review），保证病理结果和病理学报告的质量[27]。虽然同行评议不是 GLP 研究的必需项，但是各国 GLP 法规中均有提及，并且在 2019 年 FDA 颁布《非临床毒理学研究病理学同行评议指南草案：Q&A》[28]中规范了病理学同行评议的管理和实施，进一步强调了同行评议在安全性评价研究中的重要性。我们建议国内致癌性试验均进行同行评议，原因是致癌性试验根据组织病理学检查结果评价细胞在形态学上是否发生肿瘤性改变，从而判断有无致癌潜力，病理学结果的准确性是判断的关键，同行评议主要是确保病理学诊断术语的准确性和一致性，确保病理学检查的完整性，确认剂量选择的合理性，进而确保病理学报告解释的正确性[29]。
2.综合试验结果判断实验体系是否成立
根据国标GB/T 35823—2018 中关于实验动物质量的标准，使用基因修饰的动物应明确其遗传背景[30]，rasH2-Tg 小鼠转入研究机构前已完成基因型鉴定，但需要在 26 周致癌性试验中进一步确定其转入基因的表达情况，主要是基于阴性组和阳性对照组动物的死亡率和肿瘤发生情况。根据 Nambiar 等[31]在 2012 年进行的rasH2-Tg 小鼠自发病变研究，rasH2-Tg 小鼠致癌性试验阴性组动物死亡原因包括自发性肿瘤、非肿瘤性病变造成的死亡及其他原因死亡，阴性对照组动物经 26 周试验后存活率在92% ～ 100%，平均存活率在95% 以上，本文中 51 项新药致癌性研究中阴性组动物平均存活率为96%。根据背景数据[32-33]，阴性组动物死亡原因及概率见表3。
表3 rasH2-Tg 小鼠26 周致癌性试验结束时阴性对照组动物死亡原因及概率
Tab3 Mortality and percentage of animals in negative control
groups at the end of 26-week carcinogenicity test of rasH2-Tg mice
阳性组动物的死亡原因与阳性对照品诱导的肿瘤性病变有关，51 项新药中阳性组动物平均死亡率在 80% 以上。肿瘤发生情况包括肿瘤发生类型及发生率。阴性对照组动物常见自发肿瘤类型及概率见表4。
表4 rasH2-Tg 小鼠26 周致癌性试验过程中阴性对照组动物常见自发肿瘤类型及概率
Tab4 Spontaneous tumor and its percentage in rasH2T gmice during 26-week carcinogenicity test in negative control group
表 4 中的 rasH2-Tg 小鼠的背景数据显示自发概率最高的是肺部肿瘤，其次是血管瘤和血管肉瘤，但是这些自发性病变在不同研究中的数据差异性很大，且发生情况十分复杂：血管瘤在不同组织中表现出相似的特点，但不同类型的血管瘤发生率有差别；肺部肿瘤细胞形态学区别较大，分布情况不同，出现的概率也差别较大[34]。根据对照组背景数据和试验结果判定的实验动物体系可以帮助排除供试品主研究组中出现的假阳性结果，这也是致癌性试验总结报告的重要部分。
肿瘤发生情况方面，上文提及尿烷与MNU 的诱发肿瘤类型稍有不同，使用 MNU 诱发 rasH2-Tg 小鼠肿瘤的研究较多，常见诱发肿瘤类型及发生概率见表5。
表5 MNU腹腔注射给予rasH2-Tg小鼠26周常见诱发肿瘤类型及概率
Tab3 Mortality and percentage of animals in negative control
groups at the end of 26-week carcinogenicity test of rasH2-Tg mice
3.讨论
rasH2-Tg 小鼠作为皮肤致癌性试验短期替代模型的研究也在开展。在此之前 TgAC 小鼠曾作为皮肤给药致癌性研究的替代动物，但研究发现 TgAC 小鼠具有假阳/ 阴性率高、与人组织相关性不明等缺点，目前已经不再使用[33]。Suguro 等[34]使用能特异性诱导小鼠肺部肿瘤的化学致癌物1，2- 二氯乙烷经皮给予 rasH2-Tg 小鼠 26 周致癌性试验，肿瘤发病率达到100%，证明了该小鼠模型也可以考虑用于皮肤给药途径的致癌性试验。另外阳性对照品对 rasH2-Tg 小鼠的高肿瘤诱导率让研究人员发现了该品系建立疾病模型的可能。目前一些实验使用了 rasH2-Tg 小鼠进行肺部肿瘤的研究，Teruaki 等[35]借助该品系建立了化学诱导的肺癌疾病模型，用于临床前评估抗肿瘤药物药效。
随着我国医药产业的发展，临床拟用时长在 6 个月以上的创新性药物正被不断开发。致癌性试验一般在Ⅱ期临床完成后开始，上市前完成，完成一项两年致癌性试验需要 3～4 年的时间[36]，而进行一项 rasH2-Tg 小鼠 26 周致癌性试验仅大约需要 1.5 年时间。目前 rasH2-Tg 小鼠致癌性试验仍作为两年致癌性试验的附加试验，但 51 项药物中有因大鼠非相关种属经过风险评估后使用 rasH2-Tg 小鼠致癌性研究材料申报上市的例子[37]，这说明 rasH2-Tg 小鼠在解释药物致癌风险方面的权重在增加。
尽管 rasH2-Tg 小鼠不尽完善，但其对致癌物质更加敏感[38]，暴露时间远小于人体的终生暴露；与两年啮齿类动物致癌性试验相比，rasH2-Tg 小鼠试验周期短，试验结束时动物的周龄较小，因此可以排除一些老年病对结果分析的干扰；26 周试验节省供试品约90%，动物设施和饲养成本节约75%，这大大降低了临床前试验的成本，减轻了创新药申报的压力。总体而言，致癌性试验相较其他临床前试验周期长、难度大，更需要经过严谨的设计、严密的监控和合理的分析才能支持药物临床研究或上市申请。
本文来源于《药物评价研究》2022年第45卷第12期
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昭衍新药（股份代码：603127.SH/6127.HK）是中国最早从事药物非临床评价的CRO企业，1995年成立至今，已拥有近2500人的专业技术团队。昭衍新药拥有符合国际规范的质量管理体系（CNAS/ILAC-MRA认证），具备中国NMPA、美国FDA、经合组织OECD、韩国MFDS、日本PMDA的GLP资质以及国际AAALAC（动物福利）认证资质，评价资料满足全球药品注册要求。可以向客户提供非临床药理毒理学研究及评价，特别是非临床安全性评价，临床试验及药物警戒等一站式服务；还可以提供兽药、农药及医疗器械评价等服务项目。在北京、苏州、重庆、广州、上海、梧州、南宁、云南以及美国加州、波士顿设有子公司。
