小脑学习涉及多个可塑性位点的证据部分来自巴甫洛夫眼睑条件反射：切断小脑皮质会消除学习的一个组成部分——反应时间，但会保留异常时间的短潜伏期反应 (SLR) 的表达。本文，我们提供证据表明，小脑皮质损伤所揭示的 SLR 是由小脑前中间核 (AIN) 中一种联想形式的学习诱导可塑性所介导的。我们利用药物失活和/或电微刺激 AIN 的各个传入和传出位点，系统地排除了该结构上游或下游的其他可塑性候选位点。总之，结果表明小脑学习部分由小脑皮质下游靶核的可塑性所介导。这些数据证明了联想学习的一个方面 SLR 可以用作大脑特定部位可塑性的指标。
一、引言
理解学习的大脑机制需要在一定程度上建立神经可塑性过程与行为变化之间的因果关系。确定涉及的可塑性部位是这一过程的重要步骤，通常需要结合多种方法，例如可逆性损伤、刺激和记录，这些方法适用于那些基础通路已经较为明确的情况。一个这样的例子是眼睑条件反射，其中反复呈现一个条件刺激（CS，如声音）与眼部轻微电刺激（非条件刺激，US）相结合，可以促进学习，使眼睑在对CS的反应中能够及时闭合。CS和US分别通过苔藓纤维和攀爬纤维传入小脑，而学会的眼睑闭合是由小脑前间核（AIN）的活动驱动的（见图1）。眼睑条件反射与小脑之间这种相对直接的关系极大地促进了对可塑性部位及其在学习中的相对贡献的分析。
小脑皮层和/或AIN被认为是可塑性部位的候选区域，因为CS和US的输入在这些部位汇聚（见图1）。多处可塑性部位的证据来自对小脑皮层进行训练后损伤的研究。早期在兔子中的研究结果从完全消除已习得反应（指向小脑皮层是关键部位）到仅产生名义上的影响（暗示AIN具有更基本的作用）不等。许多后续研究通过测量外眼睑或瞬膜的闭合情况，报告了在直接损伤或向AIN注入GABAA拮抗剂后，出现相对较短且固定的潜伏期（约80–150毫秒）的反应。之前假设这些短潜伏期反应（SLRs）（见图1）是由AIN中的可塑性介导的。
在此，我们使用微刺激和可逆性损伤来测试这一假设。我们的结果排除了上游或下游于AIN的其他可塑性候选部位，表明SLRs反映了苔藓纤维与AIN神经元之间的兴奋性突触上的可塑性形式。它们为小脑学习通常涉及小脑皮层及其下游目标神经元（深小脑核和前庭核）中的可塑性提供了新的支持。SLRs与AIN中的可塑性之间的联系也表明，SLRs有可能被用来测量在体内特定细胞和/或突触上诱导的可塑性。
二、材料与方法
2.1 实验对象和手术
数据来自24只未经训练的新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus），实验遵循美国国立卫生研究院指南，并获得德克萨斯大学休斯顿健康科学中心动物福利委员会的批准。实验对象在使用乙酰丙嗪（1.5 mg/kg）进行预麻醉后，通过异氟醚麻醉（约1%–2%混合于氧气中）维持麻醉状态。头部在立体定位仪中固定，使lambda点位于bregma下方1.5 mm。在bregma周围进行四个颅骨切开术，插入螺钉以支撑头部。在所有实验中，均在同侧AIN立体定位植入导管（AP +0.7至约1.0 mm，ML -5.0 mm，DV -14.5 mm，以lambda为基准）。此外，在实验1至4中，分别植入以下仪器：在小脑皮层植入不锈钢电极阵列（尖端暴露约0.5–1 mm；实验1中2个电极，间距1 mm，呈冠状排列；4个电极，间距0.75 mm，呈矢状排列；实验2中在红核植入导管；实验3和4中在中脑小脑脚植入钨电极）。植入物通过牙科丙烯酸与头螺钉一起固定，并用缝线封闭任何开口。刺激电极连接到左眼的前后约1 cm处。训练在恢复后至少1周开始。
三、结果
3.1 实验1：AIN中的谷氨酸能传递对SLR表达是必需的
为了测试AIN活动是否对SLRs的表达是必需的，我们首先检查了药物操作AIN活动的效果。如果AIN是表达通路的一部分，那么抑制这一核团应该会消除SLRs的表达。我们首先对六只兔子进行声音CS与US的配对训练，以产生稳健的学习。为了确认导管放置正确，我们随后注入GABAA激动剂muscimol，以测试沉默AIN对正常条件反应表达的影响。与以往研究一致，这消除了对声音CS的正常条件反应（见图2，左上角和底部，青色）。随后，我们通过电解损伤小脑皮层来揭示SLRs（见图2，右上角，深灰色）。在两只成功损伤小脑皮层的动物中，注入muscimol也消除了SLRs的表达（见图2，右上角，青色）。这些数据表明，与正常条件反应一样，SLRs的表达需要正常的AIN活动。
图1. 眼睑条件反射如何激活小脑的示意图。声音CS激活来自桥脑核的苔藓纤维输入，眼部轻微电刺激（US）激活攀爬纤维输入（绿色），小脑前间核（AIN）的输出驱动条件反应（CR）的表达（蓝色轨迹）。通过在AIN或通过电解损伤浦肯野细胞（蓝色虚线）阻断小脑皮层，揭示了SLRs（红色轨迹）。通过多种处理方法，包括谷氨酸受体拮抗剂（实验1和2）、GABAA激动剂muscimol（实验1–4）以及苔藓纤维的微刺激（实验3、4），定位了SLRs的表达通路和可塑性关键部位。
图2. CR和SLR的表达需要AIN的活动。左上角，样本轨迹显示在AIN中注入GABAA激动剂muscimol消除了CR。右上角，样本轨迹显示在相同动物中，muscimol消除了由小脑皮层损伤揭示的SLRs（红色箭头）。在本图及后续所有图中，样本眼睑轨迹按时间顺序排列，CS呈现的时间用深灰色突出显示（无药物为深灰色，药物开始后为彩色），CS开始后的前200毫秒被加深以强调SLRs（向上偏转，眼睑闭合）。刻度条表示完全眼睑闭合的幅度（6 mm）。底部，总结数据显示在测试会话中，以36次试验块为单位，muscimol（青色）或标准训练会话（黑色和白色）在小脑皮层损伤前的CR百分比。对于本图及后续所有图中的总结数据，圆圈和条形（无药物为开放，药物开始后为填充）表示CR和SLR。误差条表示标准误。
3.2 实验2：SLRs的可塑性部位在红核上游
由于之前的实验表明AIN对SLRs的表达是必需的，但没有提供足够的证据表明SLRs的可塑性部位在AIN中。AIN中的兴奋性传递可能仅对诱导AIN或其下游部位的可塑性是必需的，或者它可能仅仅是将上游诱导的神经变化传递到前运动/运动神经元。为了区分这些可能性，我们首先测试可塑性部位是否在AIN下游。具体来说，我们询问当在红核（AIN的第一个下游目标）中阻断兴奋性突触传递时，SLRs是否能够被学习。如果可塑性部位在AIN或其上游，那么SLRs的获得应该正常进行，因为诱导可塑性所需的活动应该不受红核失活的影响。相反，如果可塑性部位在AIN下游，那么由于阻断红核中的兴奋性传递会阻止其下游的任何活动，SLRs将无法被获得。
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我们在训练兔子进行五次会话的同时，向红核注入广谱谷氨酸受体拮抗剂犬尿氨酸。通过其防止正常条件眼睑反应表达的能力来评估注入的有效性。因此，只有那些在五次训练会话中表达少于10%条件反应的动物才被纳入分析（见图4，底部，蓝色）。尽管阻断了反应表达，但在第一次训练后的测试会话中，我们通过在AIN中注入picrotoxin或gabazine，揭示了稳健的SLRs（见图4，右上角）（与T1相比，T2的t(2)=32.01，p<0.001）。在一只动物中，我们还测试了沉默红核对SLR表达的影响；通过在训练前同时向红核注入muscimol，可以可逆地消除由向AIN注入gabazine揭示的SLRs（数据未显示）。因此，与正常条件反应一样，阻断红核中的活动可以防止SLRs的表达，但不会阻止介导它们的可塑性的诱导。这些数据表明，SLRs的可塑性部位在红核上游，可能在AIN或其上游。
图4. SLRs的可塑性部位在红核上游。顶部，来自一只动物的样本轨迹，分别显示在向AIN注入gabazine之前（左，T1）和之后（右，T2）进行的两次单独会话中的108次CS单独试验。底部，总结数据显示，在训练期间没有表现出CR的动物（蓝色）仍然获得了SLRs（红色条，T2）。插图显示了一个个体受试者的冠状切片，分别显示了AIN和红核（RN）中内部导管的放置位置。
3.3 实验3：SLRs的可塑性部位在苔藓纤维下游
接下来，为了确定SLRs的可塑性部位是否在AIN中或其上游，我们询问用苔藓纤维的微刺激代替声音CS是否能够支持SLRs的获得。如果SLRs的可塑性部位在AIN或其下游，那么苔藓纤维的刺激应该能够支持SLRs；如果可塑性部位在苔藓纤维输入到AIN的上游，则不能。
我们首先使用中脑小脑脚的直接微刺激（包含来自桥脑核的苔藓纤维）作为CS来训练四只动物。与以往研究一致，苔藓纤维的刺激支持稳健的学习（见图5，顶部）。在最初的测试会话中，我们通过向AIN注入muscimol来确认导管放置正确。与对声音CS的条件反应一样，这也消除了对苔藓纤维刺激CS的学习反应（见图5，左下角）。随后，在后续的测试会话中，我们通过向AIN注入gabazine来药理学地阻断小脑皮层。与声音CS一样，这揭示了对苔藓纤维刺激CS的SLRs（见图5，中间，训练）。
图5. SLRs的可塑性部位在苔藓纤维下游。顶部，苔藓纤维的微刺激支持正常条件反应的获得。插图显示了一只动物的矢状切片，分别显示了刺激电极（MF）和内部导管（AIN）的尖端大致位置。底部，样本轨迹显示在配对会话（左和中间）或第五次消退会话（右）期间，向AIN注入muscimol（青色）或gabazine（红色）。Muscimol消除了CR（左），而gabazine即使在消退后也能揭示SLRs（右）。
3.4 实验4：SLRs的可塑性具有输入特异性
前两个实验的综合结果表明，可塑性部位在AIN中，因为它在红核上游且在苔藓纤维下游。两种一般机制中的一种，苔藓纤维与AIN突触的突触可塑性或AIN神经元内在兴奋性的全细胞增加，可能介导SLRs。为了测试这两种可能性，我们检查了由苔藓纤维刺激CS建立的SLRs的刺激特异性。如果SLRs反映了活动依赖的可塑性或/和新的苔藓纤维与AIN突触的形成，它们应该由训练CS引发，但不会由未经训练的刺激引发，尽管这些刺激（或经过训练后最终获得）能够进入AIN。相反，如果SLRs仅由AIN神经元的全细胞兴奋性增加介导，它们应该广泛地泛化到这些刺激。
与前一个实验一样，我们用苔藓纤维刺激CS训练四只动物，然后通过显示muscimol注入消除了学习反应来确认导管放置正确（数据未显示）。在后续的测试会话中，我们向AIN注入gabazine来揭示SLRs。在该会话中，我们插入白噪声试验以激活尽可能多的听觉苔藓纤维，增加检测泛化的可能性。然而，SLRs完全未能泛化到白噪声（见图6A）（t(3)=3.72，p<0.05；gabazine注入后，苔藓纤维与白噪声之间的SLRs百分比）。为了评估这种特异性是否是由于白噪声无法支持SLRs，我们用白噪声与US配对训练其中两只动物三个会话，然后第二次向AIN注入gabazine。白噪声支持稳健的学习和SLRs（数据未显示）。因此，这种刺激特异性不能归因于白噪声无法进入AIN。这些数据表明，一种高度输入特异性的可塑性在AIN中介导了SLRs。
图6. SLRs具有刺激特异性和关联性。A，由苔藓纤维刺激支持的SLRs具有刺激特异性。样本轨迹和总结数据显示，由苔藓纤维刺激建立的SLRs不会泛化到白噪声。由于后续用白噪声进行训练能够使gabazine揭示SLRs，这种SLRs的刺激特异性不是由于白噪声无法进入AIN造成的。B，SLRs仅在配对训练后被诱导。本图中的所有轨迹均来自CS单独试验。在AIN中注入GABAA拮抗剂picrotoxin在配对训练前（T1）或未配对训练后（T2）均无效，但在随后的配对训练后揭示了SLRs（T3）。
3.5 实验5：SLRs是学习的且具有关联性
有人指出SLRs可能仅仅是由于AIN的去抑制而产生的非关联性变化的结果。尽管前一个实验的结果（见图6A）表明它们是关联性的，但在最后一个实验中，我们进一步检查了这一点，询问当条件刺激（CS）和非条件刺激（US）未配对呈现时，SLRs是否会失败。如果SLRs是由AIN中的关联性可塑性介导的，那么它们应该只有在将CS与US明确配对后才会被诱导。
我们在三个不同的时间点测试了SLRs的存在：训练前、未配对训练后（在该训练中，声音CS和US明确未配对），以及最后在配对训练后（在该训练中，条件眼睑反应被习得）。在每次测试中，我们向AIN注入picrotoxin。与以往研究一致，我们在训练前未观察到SLRs（见图6B，T1）。五次未配对训练未能促进学习，重要的是，也未能支持SLRs的获得（见图6B，T2）。这种失败并非由于导管放置不当，因为我们在五次配对训练后的测试会话中揭示了SLRs（见图2，T3）（F(2,12)=75.0，p<0.001；ts(6)=8.66，p<0.001；T1或T2与T3相比）。因此，SLRs是关联性的。
四、讨论
4.1 小脑学习在小脑皮层下游的靶核中诱导可塑性
我们的结果为小脑学习在小脑皮层下游的深小脑核中诱导可塑性提供了更多证据。除了小脑皮层中的经典可塑性部位外，眼睑条件反射还在AIN中诱导可塑性。这种可塑性部位的存在最初是为另一种小脑运动学习形式——前庭眼反射（VOR）适应提出的，并且在后续研究中得到了支持。这些发现强调了眼睑条件反射和VOR适应之间的相似性，它们都是小脑运动学习的形式，分别在小脑皮层和深小脑/前庭核中的目标神经元中诱导可塑性。因此，我们的结果暗示了小脑学习中两个可塑性部位的普遍性。
4.2 SLRs的候选可塑性机制
AIN中的几种可塑性机制可能介导SLRs。有研究报道了与配对训练相关的AIN中兴奋性突触数量的增加以及苔藓纤维与AIN突触的长时程增强（LTP）。AIN神经元内在兴奋性的持久增加也可能有贡献，但这种变化必须是区域特异性的，以解释SLRs的刺激特异性。
五、结论
我们在一系列实验中表明，兔子在训练后小脑皮层损伤揭示的SLRs是由小脑前间核（AIN）中的可塑性介导的。SLRs通过AIN中的谷氨酸能传递表达，仅在刺激AIN的传入纤维或失活其下游核团时诱导，并且具有关联性和刺激特异性。我们的结果表明，SLRs反映了AIN中的突触和/或区域细胞变化，代表了一个罕见的实例，即在一个被广泛研究的关联学习方面的可塑性部位已被确定。这意味着SLRs可以被用作分析学习诱导的可塑性的细胞和分子基础的工具。鉴于获得SLRs的相对容易性以及眼睑条件反射丰富的行为特性，此类分析可以显著有助于在分子、细胞和行为水平之间建立牢固的联系。
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