我们研究了前扣带回皮层在伤害性电刺激下的传入神经及其皮层内突触组织结构。采用AM Systems的16通道电极同步记录氟烷麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠ACC全层细胞外场电位，通过电流源密度分析法计算各层的跨膜电流。研究发现存在两组主要诱发汇电流：早期组（潜伏期54.04±2.12 ms，0.63±0.07 mV/mm²）出现于V-VI层，晚期组（潜伏期80.07±4.85 ms，2.16±0.22 mV/mm²）在II/III层和V层呈现更强反应。多单元活动主要诱发于V层和II/III层深部，其潜伏期与两类汇电流高度吻合。
锥体神经元在II/III层和V层诱发的EPSP潜伏期与汇电流特征密切关联。皮层内注射谷氨酸能受体拮抗剂CNQX可抑制汇电流，而腹腔注射和皮层内注射μ-阿片受体激动剂吗啡则能增强反应。50-1000 ms间隔的成对脉冲刺激引发脉冲间抑制，高频刺激（100 Hz，11脉冲）可增强ACC诱发电位及内侧丘脑单元活动。内侧丘脑损伤可完全阻断ACC诱发反应。研究证实ACC存在两条独立突触环路介导伤害性刺激传导，且内侧丘脑是将痛觉信息传递至ACC的主要丘脑中继站。
一、介绍
疼痛是一种包含感觉辨识、情感体验、动机驱动和评估判断的多维体验。神经影像学研究表明，前扣带回皮层（ACC）在痛觉刺激下呈现稳定激活状态。当实验对象对不适感的主观认知增强时，可观测到ACC反应性显著提升，催眠暗示能够调控ACC对外周痛觉刺激的响应强度。慢性顽固性疼痛患者接受扣带回切除术后常出现情绪与人格特征改变，这提示ACC可能参与疼痛多维框架中的情感维度调控。人类、灵长类及啮齿动物的ACC痛觉神经元具有跨躯体定位分布特征，其广泛受体野可双向响应机械或热伤害性刺激，这些发现为ACC在痛觉情感维度加工中的功能定位提供了神经生理学依据。
既往研究通过后爪电刺激或激光脉冲刺激在ACC记录到体感诱发的群体兴奋性突触后电位（EPSP）及单元放电活动。诱发电位包含序列正负成分，这些特异性可重复的ACC响应模式可能在介导痛觉相关情感成分中起关键作用。解剖学研究证实内侧丘脑（MT）特定传入终末与前额叶皮层III、V层锥体细胞顶树突棘形成非对称突触连接。我们在ACC II/III层观察到密集的内侧丘脑投射终末分布。前额叶内侧皮层II/III、V、VI层锥体神经元树突束构成ACC功能柱状结构，这种模块化架构可能参与皮层传入信号的初级处理。外周痛觉信号主要通过内侧丘脑核团中继传递至ACC。
尽管内侧丘脑至ACC的解剖连接通路已明确，其皮层微环路特征仍待解析。基于16通道微电极阵列的电流源密度（CSD）分析可精确定位躯体感觉诱发响应的突触活动层间分布，为解析ACC诱发电位波形下的突触事件时空特征提供技术支撑。该技术能同步记录全皮层场电位，有效规避采样偏差引起的通道间电位波动。本研究通过在体电刺激坐骨神经激活痛觉传入通路，系统探讨ACC功能突触组织特性。实验采用多通道电极同步记录初级体感皮层（S1）与ACC的皮层外场电位，麻醉大鼠依次接受以下实验流程。
二、方法
01.动物准备
雄性Sprague-Dawley大鼠（300-400克）饲养于恒温环境（21-23°C，湿度50%，光照周期08:00起12小时明暗交替），自由获取食物饮水。所有实验均遵循中央研究院动物护理与使用委员会指南。大鼠首先在丙烯酸箱内通过4%氟烷（纯氧环境）诱导麻醉，经气管切开术插入PE-240导管，并在伤口涂抹EMLA乳膏（含2.5%利多卡因与2.5%丙胺卡因）。随后将动物固定于立体定位仪，术中持续给予2%氟烷与30%/70%一氧化二氮/氧气混合气体维持麻醉。采用恒温毯系统（型号50-7079）维持大鼠体温≥36.5°C。
于两个目标区域实施开颅术：暴露前扣带回皮层（ACC）的骨窗定位为前囟前2.5 mm、中线旁1 mm；暴露初级体感皮层（S1）的骨窗定位于前囟后1 mm、中线旁3 mm。小心移除各目标区硬脑膜，涂抹温石蜡保持皮质湿润。通过心电图持续监测心率。记录阶段维持0.75-1.5%氟烷与10%/90%一氧化二氮/氧气混合麻醉，定期通过夹尾试验评估麻醉深度，确保未出现明显反射运动或心率加速。
02.坐骨神经电刺激
双侧暴露坐骨神经后，安装定制不锈钢套筒电极。采用隔离脉冲刺激器（型号2100，AM Systems）输送双相电流（0.03-10 mA，0.5 ms脉宽，0.1 Hz），阳极置于阴极远端1 cm处。以诱发S1反应的最小电流强度为阈值，按阈值倍数实施刺激。前期研究表明：2倍阈值强度可激活无害性A-β纤维，10倍与20倍阈值分别激活伤害性A-δ与C纤维。
03.内侧丘脑电刺激
参照既往方法，将阻抗12 MΩ的单极钨电极（AM Systems）植入内侧丘脑。多数对周围刺激反应的丘脑单元定位于前囟后2.5 mm、中线旁1 mm、硬膜下5 mm区域。通过隔离脉冲刺激器（型号2100，AM Systems）向内侧丘脑输送方波恒流脉冲（0.2 ms，100-300 μA）。配对脉冲刺激的间隔设为80-120 ms。
04.机械刺激
将直径2 mm的不锈钢杆连接至8Ω/15 W扬声器的音圈，通过脉冲发生器（型号2100，AM Systems）的晶体管-晶体管逻辑脉冲触发对后爪的触觉刺激。音圈传动使钢杆产生5 mm外向位移，采用力传感器（型号1601C）测量钢杆凸起对爪面的压力。当对线圈施加10V/1 ms方波时，产生的压力为1.2 g，该压力作用于实验人员指尖时不引起痛觉。
05.诱发多通道场电位及单元活动记录
采用16触点密歇根探针（间距150 μm）记录左侧ACC细胞外场电位（定位：前囟前2.5 mm/旁1 mm；探针与垂直线呈40°角插入）。另一探针记录左侧S1后爪投射区场电位（定位：前囟后1 mm/旁3 mm；垂直皮质表面插入）。Ag-AgCl参考电极置于鼻腔，模拟信号采样率6 kHz，数据通过多通道采集系统传输至PC处理。
通过滤波场电位（200-3,000 Hz）获取诱发反应的多单元活动。以刺激前100 ms平均基线活动的平方根乘以4作为放电阈值，超阈值信号标记为"1"，亚阈值标记为"0"。累计20次多通道多单元活动试验并呈现于刺激后直方图，通过等高线图展示跨皮层层的单元活动空间分布。
06.电流源密度分析
采用CSD分析法解析诱发场电位的电流源。ACC区以平行排列的锥体细胞为主，其顶树突沿皮层层间轴延伸。坐骨神经刺激引发锥体细胞集群同步兴奋，产生垂直于皮层层的主要电流。在皮层活动均质性与细胞外电导率恒定的假设下，CSD可通过场电位在平行于皮层层轴向上的二阶空间导数估算。具体流程为：使用垂直穿透皮层层的密歇根探针，在等距线性排列的电极触点记录场电位。每次试验每通道记录外周刺激诱发的1 s场电位，各通道累计平均20-40次试验数据。针对每次记录的时间跨度与采样变异，采用五点公式平滑空间采样变异。膜电流Im通过细胞外场电位φ的二阶空间导数计算，由有限差分公式得出
其中h为相邻测量点间距（本研究为150 μm），x为垂直于皮层层面的坐标轴。其余常数为：n=2、k=4、a0=-2、a±1=0、a±2=1。
07.药物施用
通过腹腔注射给予μ-阿片受体激动剂吗啡（5 mg/kg）和拮抗剂纳洛酮（0.7 mg/kg）。皮层内注射时，将微细导管垂直插入ACC区（前囟前2.5 mm、中线旁1 mm），使用灌注泵（型号55-2222）以0.3 μl/min速度局部灌注AMPA/红藻氨酸谷氨酸受体拮抗剂CNQX（1 mM，1 μl）及吗啡（10 μg/μl，1 μl）。
08.内侧丘脑核团电解损毁
通过记录对侧坐骨神经电刺激反应功能定位MT区。将密歇根探针垂直插入与记录ACC同侧的MT区，在电极推进过程中监测丘脑活动并对坐骨神经施加电刺激。定位到刺激响应单元后撤出探针，沿相同轨迹重新插入钨电极至原深度，通过恒流脉冲发生器（AM Systems）施加100 μA、100 s直流电以抑制丘脑反应。
09.记录与损毁位点验证
实验结束时在探针最深层第16触点施加阳极电流（30 μA，5 s）制造标记点，探针回撤1000 μm后在同一导线制造第二个标记点。大鼠经生理盐水灌注后以10%福尔马林固定，冰冻切片机制备60 μm冠状脑片并行甲酚紫染色。参照大鼠脑图谱进行组织学检查以评估皮层分层结构，通过两个标记点的距离推算其余记录位点的皮层位置。
10.数据分析
通过CSD数据测定电刺激、机械刺激和激光刺激诱发汇电流的峰值潜伏期与振幅，比较给药前后汇电流变化。组间汇电流振幅采用Student t检验分析，使用单因素或双因素ANOVA评估药物、一氧化二氮或分级刺激对诱发汇电流的影响，ANOVA揭示的组间差异源通过Tukey事后检验确定。
三、结果
01.S1与ACC皮层特异性CSD图谱的确定
将两支密歇根探针垂直插入S1与ACC皮层（示意图及显微照片见图1A）。通过损毁标记点（S1与ACC显微照片中箭头所示）确定记录电极相对于皮层各层的位置。以诱发S1反应的最小刺激强度为阈值基准，用于后续实验中的刺激强度分级。
对大鼠右侧坐骨神经施加1×（阈值强度）和20×阈值电刺激时，根据左侧S1六层同步记录的平均场电位计算CSD值（图1B左）。与既往研究一致，在S1观察到两组汇电流：第一组（汇1）位于第IV层，第二组（汇2）位于第VI层。对右侧坐骨神经施加20×阈值刺激时，根据左侧ACC各层同步记录的平均场电位计算CSD值（图1B右），最显著的汇电流群位于第II/III层下部（圆圈标注），第V层可见潜伏期短于第II/III层的小幅汇电流（白色箭头）。
图1.采用两支16通道密歇根探针在初级体感皮层（S1）和前扣带回皮层（ACC）进行多通道记录，以检测对侧坐骨神经电刺激诱发的电流源密度（CSD）响应。A：密歇根探针在S1和ACC的同步记录位点示意图。显微照片显示16个接触点覆盖全部皮层，参考损毁位点由箭头标示。B：通过CSD方法转换平均场电位数据（20次扫描）获得的电刺激诱发汇电流（阴影区，向下）与源电流（向上）波形，以零电流基线为界。
02.ACC与S1诱发汇电流的比较
为评估ACC激活所需的最小有效刺激强度，我们检测了S1和ACC对不同强度刺激的反应。S1区汇1电流的振幅随着电刺激强度的增加而增大，在达到10倍阈值刺激时反应达到最大值。ACC区在10倍S1阈值刺激强度时可被激活，但需要20倍阈值刺激才能诱发最大振幅反应。值得注意的是，同侧刺激时S1区汇1电流强度明显弱于对侧刺激（图2A），而ACC区的汇电流在双侧刺激下反应相似（图2B）。ACC的最大诱发振幅比S1约低一个数量级，表明ACC需要更强的电刺激才能诱发反应。
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考虑到高强度电刺激可能同时激活多种感觉模式，为排除无害性传入纤维对ACC反应的潜在影响，我们测试了机械刺激装置施加的快速压力刺激的反应。当对后爪施加无害机械刺激时，S1区产生的反应与5倍阈值电刺激诱发的反应相似，但相同的机械刺激在ACC区未能诱发任何反应（n=3，数据未显示）。
图2. 不同强度电流刺激对侧和同侧坐骨神经诱发的S1第IV层与ACC第II/III层汇电流反应。 A：对侧或同侧坐骨神经施加电刺激（1×至20×S1阈值）后，S1第IV层的汇电流反应。下方为各刺激强度下汇电流反应的汇总数据（n=7）。 B：对侧和同侧坐骨神经施加电刺激（1×至20×S1阈值）后，ACC第II/III层的汇电流反应。下方为各刺激强度下汇电流反应的汇总结果（对侧n=8；同侧n=12）。数据以均值±标准误表示。**P < 0.01 与1×对照反应相比；***P < 0.001 与1×对照反应相比。
03.一氧化二氮效应研究
为明确麻醉维持用一氧化二氮混合气体对皮层诱发反应的抑制程度，我们在1%氟烷麻醉背景下，系统比较了不同一氧化二氮浓度时S1与ACC区诱发反应的振幅变化。实验数据显示：不同浓度一氧化二氮对各级电刺激强度诱发的S1汇电流均未产生显著影响[F(3,90)=0.422, P=0.738，见表1]，但超过2倍阈值的电刺激强度可显著改变S1汇电流[F(4,90)=39.156, P<0.001，见表1]。
同步记录的ACC汇电流既受一氧化二氮浓度影响[F(3,84)=3.857, P=0.012]，也随电刺激强度变化[F(4,84)=21.970, P<0.001]。进一步分析表明，一氧化二氮的浓度效应仅体现在：
（1）0%与30%浓度组间；
（2）10%与30%浓度组间（10倍阈值刺激时P<0.05，见表2）。
特别值得注意的是，在0%一氧化二氮(P<0.01)和10%浓度(P<0.05)条件下，10倍阈值刺激诱发的反应与低强度刺激间均存在显著差异（见表2）。由此证实：本实验采用的10%一氧化二氮浓度既不影响S1诱发反应，对分级电刺激后的ACC反应也无显著抑制作用。
表1.坐骨神经分级电刺激诱发S1第四层汇电流的一氧化二氮浓度效应
表2.一氧化二氮浓度对坐骨神经分级电刺激诱发ACC第II/III层汇电流的影响
04.记录角度与皮层亚区特异性对CSD图谱的影响
为评估外周刺激诱发的CSD图谱特征，研究人员以不同角度将密歇根探针插入内侧前额叶皮层各亚区。在ACC 1区（Cg1）采用与皮层垂直、与中线呈40°夹角的记录角度时，可获得典型的第II/III层强汇电流激活响应（图3B）。当以更大插入角度到达更深的前边缘皮层（PrL）时，反应幅度显著小于Cg1区（图3A）。垂直插入次级运动皮层（M2）、Cg1和PrL第II/III层的探针未检测到明确汇/源电流成分（图3C）。初级运动皮层（M1）的诱发反应主要集中于第V层（图3D）。这种跨亚区的皮层汇/源电流模式在多只大鼠中表现一致（PrL，n=6；ACC斜向插入，n=7；ACC垂直插入，n=3；M1，n=4）。
图3. 对侧20×S1阈值刺激在PrL、ACC和M1区诱发的皮层汇/源电流。示意图显示用于记录活动的密歇根探针的角度和位置。右侧展示PrL、ACC斜向插入、ACC垂直插入及M1区的典型诱发皮层汇/源电流波形。
05.ACC区CSD图谱特征分析
本研究获得的CSD数据均来自经组织学验证插入角度的Cg1区。图4B-H展示了7例独立实验中对侧坐骨神经20×S1阈值刺激后在ACC区诱发的CSD响应，图4A为密歇根探针轨迹的相对位置重建图。分析发现第II/III层和第V层存在多个显著的CSD特征性表现，这些汇电流成分在不同动物间具有可重复性。
由于以下因素，我们采用代表性总体平均法而非直接平均法进行数据分析：各实验记录位点相对于皮层分层的差异；不同动物皮层各层的厚度存在轻微变异。该方法可准确识别个体汇电流与源电流成分。
图4.ACC区平均CSD数据及对应多单元活动；A：密歇根探针在ACC区的7个穿刺轨迹示例；B-H：20×S1阈值刺激后，ACC区7组平均CSD及其对应多单元活动示例
我们根据每只动物的损毁标记确定了电极位置的组织学精确定位。所有动物均在第II/III层与第V层交界处观察到三个主要汇电流，因此将该交界作为CSD图谱对齐的参考基准。七只动物的第I层和第II/III层皮层厚度一致，而第V层和第VI层厚度存在一定变异：其中4例（图4B-E）第V层覆盖4个电极，2例（图4F-G）覆盖5个电极，1例（图4H）覆盖6个电极。我们选择4电极覆盖作为第V层标准厚度，其余3例中第V层的额外通道数据由相邻第VI层通道替代（图4F-H）。
经CSD波形重新调整后，对七只动物的CSD进行逐迹线平均。各CSD波形间变异较小（图5A，黑线=均值，灰线=均值±标准误）。总体平均CSD中所有汇/源电流成分在个体CSD中均可识别，表明不同动物间CSD响应具有高度一致性。早期汇电流群（潜伏期54.04±2.12 ms，n=7，图5A箭头）完全位于深层（V-VI层），其最早成分出现于第VI层；第二早期汇电流群（潜伏期80.07±4.85 ms，n=7，图5A箭头）位于第II/III层深部及第V层上部，振幅显著大于第一组（2.16±0.22 vs. 0.63±0.07 mv/mm2）。位于第VI层下部和第II/III层上部的两个晚期汇电流群可能代表向两个早期汇电流群的不同皮层内多突触连接。各层主要汇电流的振幅与潜伏期数据见表3。
图5. 坐骨神经20×S1阈值刺激后ACC区诱发的CSD及多单元活动。A：对图4中对侧坐骨神经20×刺激诱发的波形进行总体平均（黑线）及标准误分析（灰线）。B：7只动物多单元活动的叠加结果。C：多单元活动叠加轮廓图与CSD总体平均彩图的叠加展示
表3.ACC各层诱发汇电流的总体平均振幅与潜伏期
06.ACC区的CSD与多单元活动
图4B-H右侧面板展示了坐骨神经20×S1阈值刺激在ACC区诱发的7组多单元活动。这些数据采用与CSD波形相同的对齐和调整方法进行处理，其叠加结果见图5B。图5C显示了多单元活动轮廓图与CSD总体平均彩图的叠加效果。最强的多单元活动出现在ACC区第V层上部，CSD彩图中白色虚线箭头标示了两股汇电流的深度-时间传导路径。最大多单元活动范围覆盖整个第V层及第III层下部。
07.扣带回神经元细胞内记录
在内侧前额叶皮层共记录到21个神经元，其中6个对20×S1阈值刺激产生反应（图6A上）。这6个神经元的平均膜电位为-57.83±3.52 mV，平均膜电阻为16.41±2.90 MΩ。图6A(a,b)分别展示了第II/III层和第V层记录的两个锥体神经元及其显微描绘图。图6B(a,b)同步显示了这些神经元的突触反应与多通道汇电流记录。图6B(a,b)上中部分别为诱发的CSD模式和锥体神经元EPSP叠加图，底部为该神经元在20×S1阈值刺激后的动作电位事件直方图。诱发EPSP的响应潜伏期为27.8-121.0 ms（67.8±41.3 ms，n=6），第II/III层和第V层锥体神经元的EPSP峰值反应与伤害性电刺激后第II/III层的汇电流具有对应关系（图6B垂直虚线）。
图6. 细胞内突触反应与同步记录的CSD图谱的对应关系 。A：电生理实验装置示意图。细胞内记录神经元的位置与分布标注于标准图谱冠状切面，空心圆代表无反应神经元，实心黑圆代表反应神经元。(a)和(b)分别展示第II/III层与第V层锥体神经元与多通道汇电流的同步记录，白色箭头指示记录神经元在ACC区的位置，右侧附皮层分层标注的神经元显微描绘图。 B：两组锥体神经元对应的诱发皮层汇/源电流与其兴奋性突触后电位(EPSP)叠加图，下方为坐骨神经20×刺激后诱发动作电位的围事件直方图。
08.传导速度测定
通过测量不同刺激位点（坐骨神经vs趾端）诱发ACC与S1汇电流的潜伏期差，计算外周传入纤维的传导速度。ACC第V层汇电流在对侧与同侧刺激下的传导速度分别为8.69±1.43 m/s（n=5）和5.42±0.62 m/s（n=3）；第II/III层汇电流则分别为5.25±0.79 m/s（n=6）和6.11±0.33 m/s（n=4）。S1区对侧刺激诱发汇1电流的传导速度为33.96±4.06 m/s（n=6）。电刺激诱发ACC主要汇电流的传导速度属于A-δ纤维范围，而S1快速反应则属于A-β纤维范围。
09.配对脉冲与高频刺激
为研究ACC区内反应的可塑性，对坐骨神经施加配对脉冲及高频强直刺激。采用相同参数的成对刺激（间隔50-2000 ms）发现：当第二脉冲在首次反应后50-1000 ms内施加时，ACC第II/III层CSD反应与MT区多单元活动均出现配对脉冲抑制（图7B，ACC n=7，MT n=16）。高频刺激（11脉冲，100 Hz）可增强第II/III层与第V层汇电流反应（图7C），且MT单元活动与第II/III层积分汇电流高度相关（插图，r=0.91，n=14，P<0.001）。直接电刺激MD核时，ACC第II/III层CSD反应表现为配对脉冲易化（图7D示意图，7F数据），在50-100 ms间隔时变化显著（图7E,G，n=5）。高频刺激（100 Hz，11脉冲）期间晚期汇电流明显增强。
图7. 配对脉冲与高频刺激对电诱发皮层汇电流的影响 。A：同步记录内侧背侧丘脑核与ACC区活动的双探针布局示意图，空心圆代表无反应神经元，实心黑圆代表反应神经元。 B：ACC第II/III层汇电流（n=7）与内侧丘脑（MT）多单元活动（n=16）在对照条件及50/100/2000 ms配对脉冲刺激下的总体平均叠加波形。50-1000 ms间隔的坐骨神经配对刺激均引起ACC第II/III层CSD反应与MT多单元活动的配对脉冲抑制（与首次反应相比；n=7）。 C：高频刺激（100 Hz，11脉冲）后ACC反应与MT单元活动的增强示例，插图为二者相关性分析。 D：记录ACC活动的密歇根探针与刺激MD核的钨电极布局示意图，黑点代表刺激位点。 E：单脉冲刺激、100 ms配对脉冲及高频刺激（100 Hz，11脉冲）后ACC第II/III层诱发汇电流的示例波形。 F：直接刺激MD核诱发的CSD图谱。 G：50-100 ms间隔的MD核直接电刺激在ACC第II/III层CSD反应中诱发配对脉冲易化（第二次反应相对于第一次的增强；n=5）。 *P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。
10.ACC区CNQX皮层内注射的效应验证为确认ACC第II/III层与第V层诱发汇电流的谷氨酸能神经传递属性，研究人员在距密歇根探针300-400 μm的ACC区注射1 mM CNQX溶液（1 μl）（图8A示意图）。皮层内注射CNQX后，第II/III层和第V层的汇电流振幅均出现显著抑制，恢复时间约需2小时（图8C，n=4）。作为对照，单独注射人工脑脊液（n=3）对第II/III层汇电流振幅无显著影响（图8B）。该结果证实ACC区诱发汇电流的产生依赖于AMPA/红藻氨酸受体介导的谷氨酸能突触传递。
图8. 皮层内注射CNQX对诱发皮层汇电流的影响。A：CNQX（1 mM，1 μl）皮层内注射显著抑制ACC第II/III层与第V层汇电流振幅。B：人工脑脊液注射组（n=3）第II/III层汇电流无显著变化。C：CNQX注射组（n=4）第II/III层与第V层汇电流振幅降低。*P < 0.05
11.吗啡给药对神经活动的调控效应
腹腔注射吗啡（5 mg/kg）未显著影响S1区汇电流（图9A，n=5），但可增强ACC第II/III层汇电流振幅，并轻度提升第V层反应（图9B，n=5）。ACC区直接灌注吗啡（10 μg/μl，1 μl）使第II/III层汇电流显著增强（n=7），第V层亦出现轻度增强（n=3）（图9C）。
图9. 吗啡对皮层汇电流的调控作用。A：腹腔注射吗啡（5 mg/kg）对S1第IV层诱发汇电流的典型影响（n=5），显示该区域汇电流未受显著改变；B：腹腔注射吗啡（5 mg/kg）对ACC第II/III层（n=5）与第V层（n=4）汇电流的增强效应，其中第II/III层振幅显著增加；C：ACC区皮层内注射吗啡（10 μg/μl，1 μl）对第II/III层（n=7）与第V层（n=3）汇电流的差异化增强作用。*P < 0.05；**P < 0.01
12.内侧丘脑(MT)诱发多单元活动及其失活效应伤害性电刺激可在MT多个核团诱发多单元活动。图10A显示15条多通道电极轨迹及其在MT的验证位置，实心圆代表检测到诱发活动的记录位点，空心圆代表未检测到活动的位点。诱发活动主要集中于内侧背核(MD)，但在中央外侧核(CL)、旁中央核(PC)、腹外侧核(VL)和束旁核(PF)也有记录。各丘脑核团平均多单元活动见图10A。
图10. 内侧丘脑(MT)诱发多单元活动及其失活效应。A：对侧坐骨神经20×电刺激后MT区伤害性反应神经元（实心圆）与无反应神经元（空心圆）的分布。上方显示在MD、CL、PC、PF和VL核团记录到的诱发多单元活动，灰色轨迹为各定位点的叠加活动，粗线为总体平均。B：MT损毁位点示意图，浅灰区域显示单只动物的损毁范围，深灰区域代表所有动物（n=8）的共同损毁区。C：MT损毁前后S1与ACC诱发汇电流比较。损毁后ACC第II/III层与第V层的刺激诱发汇电流显著降低（n=4）***P < 0.001，而S1第IV层汇电流未受显著影响（n=4）。
为评估内侧丘脑(MT)在向ACC传递伤害性输入中的相对贡献，研究人员进行了电解损毁实验。损毁区域主要覆盖MD、CL、PC、VL和PF核团（图10B），MT损毁完全阻断了诱发CSD电流（图10C；n=4）。
四、讨论
本研究通过坐骨神经高强度电刺激探索了ACC区内神经环路的激活模式。首次证实：基于ACC层状场电位的CSD分析可揭示汇/源电流的离散时空分布特征。解读CSD图谱需结合局部解剖特征及相同刺激诱发的多单元与细胞内反应特性。来自MD和PF核的丘脑-扣带回传入纤维终止于第II/III层和第V层锥体神经元树突，这些突触连接可能解释上述深度出现的初始诱发汇电流。细胞内记录显示，第II/III层和第V层锥体神经元产生的顺向驱动EPSP，其刺激后潜伏期与诱发汇电流相当。在第III-V层交界处观察到强烈的多单元活动，表明动作电位沿皮层内通路传导。这些发现提示：高强度外周电刺激激活的丘脑输入可能兴奋ACC第II/III层和第V层锥体神经元，进而通过多突触连接激活浅层与深层的皮层内环路。
01.ACC区伤害性反应特征
诱发ACC区明确汇/源电流至少需要10倍S1阈值强度。ACC第II/III层早期汇电流群的潜伏期长于S1第IV层诱发汇电流。虽然这种差异可能部分源于上行体感通路不同核团的中枢处理过程，但外周信号阈值与传导速度的比较强烈提示差异至少部分起源于外周。早期诱发汇电流群的传导速度属于A-δ纤维范围，坐骨神经强电刺激可能同时激活皮肤A-δ传入纤维与被认为是伤害性的III类深部感受器传入纤维。因此激活ACC区内环路的外周传入很可能是伤害性的。这些结果与既往关于ACC神经元对伤害性刺激反应的研究一致。虽然ACC通过A-δ纤维接收双侧躯体输入，但该区域明显缺乏S1中存在的A-β纤维输入，表明ACC处理的体感信息与S1存在本质差异。
02.ACC区汇/源电流分布与突触组织结构
外周伤害性电刺激在ACC区诱发出两种时空特征不同的皮层内汇/源电流模式。不同皮层层的汇电流聚集是兴奋性突触分层排列的结果。各汇电流及其互补源电流的空间分布表明，具有延伸树突结构的兴奋神经元参与了连续的皮层内兴奋网络。细胞内记录的锥体神经元EPSP与汇电流的高度吻合强烈提示，这些早期诱发汇电流本质上反映了神经元集群活动。CSD分析显示，早期突触激活首先独立发生于第II/III层和第V层，随后经突触传递至更浅层和更深层，前者的振幅数倍于后者，反映了各汇电流位点皮层内突触连接的整体强度。
第II/III层的早期汇电流伴随更浅层的源电流，这种分布提示传入纤维终止于该层锥体神经元垂直走向树突的棘突，形成局部汇电流并在顶端树突产生远端源电流。第II/III层上部的汇电流具有依次延长的潜伏期，可能反映向上传导的皮层内突触电流流形成多突触连接。
第V层最早出现的汇电流位于V-VI层交界附近，潜伏期短于第II/III层，可能反映丘脑皮层传入投射对深层神经元的激活。该汇电流与第II/III层下部的源电流互补，其时空特征提示存在与第II/III层类似的兴奋性突触作用模式。多项研究证实ACC第V-VI层存在伤害性特异性神经元。深层后续汇电流的较长潜伏期表明存在多突触连接，可能源于第VI层神经元轴突侧支对第V层神经元的支配，这种循环兴奋可能促成深层晚期汇电流，导致扣带回神经元产生长时程循环兴奋。
当前与既往研究中发现的MT刺激对ACC第II/III层汇电流的强激活作用表明，该层汇电流可能接受来自MT的直接兴奋性突触输入。我们近期通过顺行标记证实，MT传入纤维主要终止于ACC第II-III层。类似研究也发现丘脑向该脑区第II/III层和第V层的主要投射。
03.皮层内谷氨酸能突触传递
CNQX对ACC区内汇电流的阻断作用明确表明，AMPA/红藻氨酸谷氨酸受体介导了扣带回神经元突触前丘脑输入的兴奋性驱动。谷氨酸能丘脑-皮层通路已被前人描述，多项电生理研究指出这些丘脑输入是扣带回神经元谷氨酸能输入的主要来源。
04.吗啡对ACC的调控作用
与我们先前发现全身给予吗啡优先影响S1区C纤维诱发的长潜伏期汇电流不同，本研究发现吗啡对ACC伤害性驱动汇电流具有兴奋作用。这种兴奋效应可能是吗啡对上行伤害性通路多级结构的综合作用结果。然而，ACC局部注射吗啡产生的显著兴奋效应证实其对该脑区具有直接作用。全身给药的更强效应可能源于吗啡对其他调控ACC活性脑区的影响。
ACC区存在中高密度的μ型和δ型阿片受体。δ受体激活可使部分锥体神经元超极化，并通过突触前抑制减少兴奋性氨基酸和γ-氨基丁酸（GABA）的释放。局部应用μ受体激动剂可减弱谷氨酸诱发的扣带回神经元放电。我们近期证实吗啡处理可抑制MD丘脑传入诱发的前额叶神经元反应。因此吗啡对扣带回神经元的兴奋作用可能通过不同通路或细胞环路介导。在海马和中脑导水管周围灰质中已发现吗啡通过抑制GABA能中间神经元增强兴奋性突触传递的证据。丘脑-扣带回末梢既与GABA能中间神经元也与ACC主神经元形成突触，这种结构使GABA能中间神经元能通过前馈抑制调控主神经元，且突触前后GABA能末梢的存在可能使丘脑传入激活后产生中间神经元去抑制。
目前仍缺乏吗啡直接作用于扣带回皮层GABA能中间神经元的直接证据。但值得注意的是，大鼠ACC区的非锥体神经元在μ型阿片受体激活后会出现超极化，且部分前额叶神经元在吗啡存在时对MD丘脑刺激的反应增强。因此，吗啡可能通过抑制GABA能中间神经元来降低对主神经元的抑制水平，从而增强ACC区的诱发汇电流。
ACC区阿片受体的激活可产生强效镇痛作用。近期人类神经影像研究表明，μ型阿片受体激动剂芬太尼诱导的镇痛作用伴随ACC区局部脑血流量增加。吗啡的脊髓上镇痛作用可能部分通过激活从ACC到皮层下区域和脊髓的下行调节系统介导。
05.短时程突触可塑性
MT-ACC传入通路的配对脉冲刺激可诱导同突触短时程易化，观察到第II/III层汇电流振幅明显增加。该结果与既往关于ACC短时程神经可塑性的研究一致。增强位点可能位于MT传入纤维在深层锥体神经元顶树突和基树突的初始末梢区。同时，MT输入的高频刺激可增强汇电流。这些发现强有力地表明，ACC的单突触和多突触环路可随丘脑输入的持续流入而发生可塑性改变。与直接激活丘脑输入的效果相反，外周输入的配对脉冲刺激产生抑制效应。由于第二脉冲诱发的MT单元活动减少与该抑制效应相关，这种抑制可能通过丘脑或上行伤害性通路的多级结构介导。
06.丘脑中继传递
本研究汇聚了两方面证据表明ACC的伤害性反应主要由MT核团传递的A-δ伤害性传入纤维传导：首先观察到丘脑单元活动与ACC诱发汇电流的关联性；其次证实MT刺激可直接诱发ACC反应。确实，既往电生理研究显示MT的MD和CL核神经元对伤害性刺激有反应。更重要的是，选择性MT损毁可完全阻断A-δ伤害性通路向ACC的传递，这进一步强调了MT在内侧痛觉系统传递情感性伤害信息中的关键作用。
07.功能意义
本研究结果支持以下观点：ACC 可能在疼痛的情感方面发挥重要作用。近期的人体研究表明，疼痛存在一种并行处理模式，最可能由平行丘脑皮质投射至多个皮质区域（包括 ACC）所介导，且带有强烈情感成分的疼痛与 ACC 的活动密切相关。我们的 CSD 分析结果显示，A-δ 纤维激活的皮质内突触电流模式不同于与辨别功能相关的 S1 区 A-β 纤维激活电流；例如，上行 A-δ spino-ACC 通路表现为双侧激活，且对刺激强度的依赖性低于 A-β 纤维系统。与 ACC 在疼痛情感方面具有更广泛作用一致，先前的电生理研究表明，伤害性 ACC 神经元具有较大的感受野。
II/III 层汇流电流在浅表层启动皮质内多突触兴奋，被认为与区域间皮质突触网络中的突触相互作用有关。深层突触电流的向下扩散表明，皮质信号可能通过 cingulatefugal 通路传递至亚皮质结构（如 MT 和导水管周围灰质）。脊髓通路和皮质回路的共同作用使 ACC 能够整合来自身体两侧的伤害性 A-δ 纤维传递的信息。因此，伤害性 A-δ 纤维对 ACC 的双侧兴奋，以及来自 ACC 的下行输出在皮质和亚皮质区域产生的更弥散激活，可能有助于将伤害性信号从 ACC 传递至亚皮质区域，以进行进一步的伤害性信息处理。
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