我们报道了一种非接触式光学测量方法，无需外源化学物质或反射涂层，即可测量甲壳类动物神经在动作电位传播过程中的快速瞬态结构变化。这项名为谱域光学相干断层扫描的技术，能够提供神经的实时横截面图像，分辨率达微米级，可用于选择特定区域进行功能评估，并利用干涉相位灵敏度进行亚纳米级运动检测。非接触式光学测量结果证实了小龙虾和龙虾神经中与动作电位传播相关的1毫秒时间尺度上的纳米级瞬态运动。
一、引言
自20世纪50年代初以来，神经动作电位（APs）的光学检测一直备受关注。其非接触、非侵入的特性且无需对比剂，使其能够在许多其他方法无法实现的神经生物学研究中得到广泛应用。非侵入性神经活动检测对于早期发现神经疾病至关重要，包括对人类视网膜神经功能的活体评估，因为神经细胞死亡是不可逆的。细胞内或细胞外电极可以测量AP传播期间膜电位的变化，但其对神经纤维的不可达性或潜在损伤是一个缺点。可光学检测的神经活动迹象包括吸收、光学旋转、延迟、荧光、光散射和体积变化的变化。许多研究已经报道了光学仪器，然而，能够在临床环境中测量单个AP传播的单一非侵入性/非接触设备一直难以实现。这是由于测量的侵入性或传输模式几何结构。
这里，我们提出一种方法，能够提供神经组织的横截面图像，并允许在神经的许多深度位置同时以亚纳米轴向分辨率和亚毫秒时间分辨率测量瞬态变化。在AP传播期间，与瞬态结构变化相关的内在光学对比机制可以在毫秒级时间分辨率内被检测到。1968年，研究人员展示了在蟹类行走腿的神经束和乌贼巨大轴突中，神经活动期间的光散射和双折射变化。同年，研究人员报告了在龙虾和蜘蛛蟹腿的神经干以及乌贼鳍神经中，荧光、浊度和双折射的变化。瞬态光学变化也发生在电鳗的电器官和梭鱼的嗅觉神经中。在功能神经中，可能包括膜分子的重新定向、离子的流入和流出以及轴突直径的变化，这些生化和结构变化有助于产生这些光学信号。
与AP传播伴随的瞬态结构变化尚未被充分理解，但神经活动期间的机械变化，如神经结构的膨胀和收缩，可以被光学检测到。50多年前，研究人员就使用光学仪器研究了乌贼、蟹类或龙虾腿神经的未髓鞘轴突受到刺激时的体积变化。利用激光干涉仪测量了在轴突表面有纳米直径金颗粒存在的情况下，龙虾巨大轴突的快速直径变化。测量到的相位变化表明，轴突表面在1ms期间收缩了1.8纳米，随后缓慢膨胀。此外，通过使用金颗粒增强轴突表面的反射，光纤传感器测量到乌贼巨大轴突在1ms期间的0.5纳米膨胀。研究人员利用固定在压电陶瓷弯曲器上的探针装置，在银鱼嗅觉神经中报告了快速的机械变化。膨胀信号和AP几乎同时达到最大值。在防水室内测量快速变化的静水压力，表明神经活动期间的缩短和膨胀事件并没有相互抵消。此外，研究人员利用光学杠杆和刀刃边缘报告了龙虾神经的0.1–0.8纳米膨胀。所有这些报告都表明了功能神经的结构变化。
传统的或时域光学相干断层扫描（OCT）可以非侵入性地检测神经反射率和散射的缓慢变化（几秒到几分钟），但这种OCT系统对AP传播伴随的快速（毫秒）和小（纳米）变化不敏感。最近，研究人员报告了从龙虾和蟹类腿神经束中测量与AP传播相关的瞬态表面位移，这些测量是通过差分相位干涉法进行的。在这些测量中，从单一点记录了纳米级表面位移。
最近，OCT技术的发展，特别是光谱域OCT（SD-OCT）的出现，极大地提高了灵敏度和相位稳定性。SD-OCT提供了同时的强度和干涉相位信息。干涉强度可以产生实时高分辨率（2–10μm）的结构图像，这些图像可用于选择神经组织中特定的感兴趣区域进行功能检测。由于其优越的相位稳定性，可以检测到亚纳米范围的光程长度变化，并且具有34μs的时间分辨率。因此，SD-OCT技术具有测量与AP传播直接相关的瞬态结构变化的时间分辨率和相位灵敏度。基于SD-OCT的这些吸引人的特性，我们报告了在神经的整个深度轮廓上多个点与AP传播相关的瞬态表面位移。如果在兴奋期间的瞬态结构变化能够选择性地指示功能性和功能障碍性神经区域，那么光学方法可以用于研究神经机制，特别是在实验室环境中，并且未来可能会导致神经疾病的早期检测。
二、材料与方法
2.1 系统描述
OCT是一种非侵入性光学技术，可以创建生物组织的横截面图像，具有几微米的分辨率，深度可达1–2mm。它类似于超声成像，只是使用的是背散射光而不是声波。在传统的或时域OCT中，迈克尔逊干涉仪的参考臂长度快速扫描以创建样品的深度轮廓。另一种方法是通过光谱仪测量迈克尔逊干涉仪检测臂的光谱，而不是扫描参考臂。光谱仪通过光栅分散检测臂的光，并通过电荷耦合器件（CCD）线扫描相机测量光谱。在SD-OCT中，不需要对参考臂进行机械扫描，这极大地提高了相位稳定性。深度信息是通过光谱的傅里叶变换获得的。图1显示了一个基于光纤的SD-OCT系统的示意图，其样品臂中有一个神经腔室。
图1. 基于光纤的SD-OCT设置和其样品臂中的神经腔室的示意图。光学设置测量神经相对于静止的玻璃-生理盐水界面的运动。神经被放置在20mm长、1mm宽的凹槽中。电刺激和记录电极由铂制成。通过在样品上横向扫描光束可以获得横截面图像；然而，在实际测量期间光束是静止的。ASL，三元素空气间隔透镜；C，光束准直器；G，透射光栅；LSC，线扫描相机；SLD，超荧光二极管；Ti:Sapph，锁模钛宝石激光器。插图显示了光学读出。
我们使用宽带光源，如超荧光二极管或锁模钛宝石激光器，以获得高轴向分辨率（在组织中分别为约6μm和2.5μm）。在样品臂中，准直光束的1/e²直径约为3.4mm，显微镜物镜的数值孔径约为0.4。由样品路径光学决定的横向分辨率约为4μm。在检测臂中，我们定制的光谱仪，配备60mm焦距的消色差准直透镜、1200线/毫米的透射光栅和100mm焦距的空气间隔成像透镜，将光谱投射到由2048个像素组成的CCD线扫描相机上，每个像素大小为10μm×10μm。
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神经腔室由有机玻璃制成。为了通过电刺激和记录AP，将铂电极放置在神经腔室的池中，并用环氧树脂固定。神经所在的凹槽长约20mm，宽1mm。在两个记录电极之间，将显微镜玻璃粘贴在凹槽上方，以便可以测量神经相对于这个静止的玻璃-生理盐水界面的运动。
2.2 检测 SD-OCT
检测臂光谱仪中的干涉图样可以描述如下：从参考臂返回的场作为波矢量k的函数，由E(k)给出，源光谱S(k)由S(k)=E(k)E*(k)给出。从样品臂反射后返回的场由Es(k)=E(k)[α1exp(ikz1)+α2exp(ikz2)+...]给出，其中E(k)是入射在样品上的场强，α1和α2分别是位于z1和z2处的反射率的平方根。探测器处的强度作为波矢量k的函数，由样品和参考臂光的干涉给出，SSD(k)=S(k)[1+2α1cos(kz1)+2α2cos(kz2)+...]，其中假设α1和α2远小于1。从这个方程可以看出，空间信息通过2αcos(kz)的调制编码在源光谱之上。例如，在干涉仪的样品臂中放置了一个反射器，并在检测臂中测量了光谱。测量到的光谱如图2A所示，其傅里叶变换显示了样品臂中的空间信息，如图2B所示。
图2. SD-OCT测量深度分辨结构的描述。（A）干涉仪检测臂中的光学光谱，由于样品臂中的单个反射表面，光谱上出现了强烈的调制。（B）光学光谱的傅里叶变换，给出了样品臂中的空间信息。零点处的峰值是源光谱的傅里叶变换；240μm处的峰值是由反射物体引起的光谱调制。峰的宽度对应于轴向分辨率，与光源光谱的带宽成反比。
SSD(k)的傅里叶变换结果是一个复函数 ̃ SSD(z)。图2B中的反射率曲线由|̃SSD(z)|²给出。每个深度位置的相位ϕ(z)可以通过四象限反正切法计算出虚部和实部的值，其中ϕ(z)∈[-π,π]。为了消除干涉仪中的共模噪声，特定点z处的相位从参考表面（玻璃-生理盐水界面）的相位中减去。相位差Δϕ(z)直接与由于神经活动期间的位移而导致的光程长度变化Δp(z)相关，由Δϕ(z)=2(2π)/λ₀Δp(z)给出，其中λ₀是光源的中心波长。原则上，光程长度变化Δp(z)可能源于样品折射率和/或物理尺寸的变化，因为光程长度是折射率和物理长度的乘积。由于i）龙虾神经的上表面导致了纳米级位移，ii）在10–20皮米分辨率下，放置在神经上下方的两个固定表面之间的光程长度变化无法检测到，因此我们的纳米级光程长度变化并非归因于折射率变化，而是归因于AP传播期间神经内部的物理位移。
2.3 灵敏度
为了确定可以测量的最小位移，在SD-OCT系统的样品臂中放置了一片玻璃载片。玻璃载片的前表面作为参考表面，玻璃载片的后表面作为测量相位差Δϕ(z)或位移Δp(z)的位置。理想情况下，位移Δp(z)应该为零。每隔35μs进行一次测量，持续21s，信噪比（SNR）约为100.4dB。测量的标准差显示出惊人的25皮米精度。相位灵敏度是SNR的显式函数，相位方差与SNR的关系如下方程所示：⟨Δϕ²⟩≈1/2(SNR)。基于SNR的预测精度为0.4皮米。理论与测量之间的差异很容易归因于玻璃载片中存在的振动。在神经实验中，组织中的SNR降低和运动伪影可能需要信号平均以观察与AP传播相关的纳米级瞬态结构变化。
三、结果
从龙虾的前行走腿（螯肢）中提取神经，在解剖显微镜下进行操作。使用205mM NaCl、5.3mM KCl、13.5mM CaCl₂·2H₂O和2.45mM MgCl₂·6H₂O的细胞外溶液，用NaOH将pH值调整至7.4，在解剖期间和解剖后用于浸泡龙虾神经。用缝线系住神经束的两端，防止轴浆泄漏，并协助定位。将神经放置在凹槽中后，用凡士林将容纳电极的槽彼此电隔离。使用隔离脉冲刺激器（型号2100，A-M Systems）生成并向神经施加50μs持续时间的可调电流脉冲。通常，对1mA或更低刺激表现出信号传播的神经被认为是可行的。连接到记录电极的差分放大器（型号1800，微电极交流放大器，A-M Systems）测量AP，其低频和高频截止频率分别设置为10Hz和10kHz。AP显示在示波器屏幕上，以监测每次响应的重复性。对多个响应进行平均以增加信噪比。各个电流脉冲之间的时间间隔为270ms（3.7刺激/秒）。整个系统，包括SD-OCT系统和电刺激及记录设备，由一台计算机控制，以确保光学和电信号的同时记录。
图3展示了在龙虾腿神经中AP传播的光学检测。图3A显示了一个深度轮廓的后向散射光强度。作为我们测量中的参考，玻璃-生理盐水界面和神经下方的多个神经表面都是可见的。在显示位移的深度位置中，选择了两个位置，分别位于龙虾神经内的L1（在聚焦点内）和L2（产生最大位移的位置）。在AP传播期间，由于瞬态位移导致的L1和L2位置的光程长度变化，以及相应的复合AP作为时间的函数绘制在图3B中。刺激脉冲（1mA，50μs）在2ms时呈现，并在电信号中产生一个局部伪影，随后是一个复杂的复合AP。在L1和L2点，分别测量到2纳米和3纳米的光程长度变化。光程长度变化除以介质的折射率（约1.33）得到实际位移的大小，分别为L1的1.5纳米和L2的2.25纳米。瞬态增加的光学信号表示向参考玻璃表面方向的位移。瞬态信号的持续时间约为1–2ms，与AP到达光学测量区域的时间一致。为了降低噪声，平均了50个位移轮廓。AP也进行了平均以便于比较。光学和电信号都具有5kHz的带宽。在光学信号的前2ms（图3B）中，L1和L2位置的噪声标准差分别为0.19纳米和0.3纳米。L2位置的较高噪声水平可以归因于深度轮廓（图3A）中所示的较低信噪比。在本测量中，使用中心波长为840纳米、带宽为50纳米的超荧光二极管（Superlum Diodes），在组织中产生了6微米的轴向分辨率，用于结构轮廓。聚焦点处的样本光束直径约为4微米（瑞利范围：约15微米），神经上的光功率不超过1毫瓦。
图3. 在龙虾腿神经中AP传播的光学检测。（A）深度轮廓显示玻璃-生理盐水界面和神经内的多个表面。标签L1和L2表示龙虾神经内的两个位置。（B）在AP传播期间，由于瞬态位移导致的L1和L2位置的光程长度变化，以及通过放置在光学读出区域前后的一对铂电极相对于地电位差分记录的相应复合AP。瞬态增加的光学信号表示向参考玻璃表面方向的位移。刺激（1mA，50μs）在2ms时呈现，并在电测量中产生一个局部伪影。每个轨迹平均了50个响应。
我们用从当地获得的龙虾的行走腿中提取的神经束重复了相同的实验。在这种情况下，为龙虾神经准备了462mM NaCl、16mM KCl、26mM CaCl₂·2H₂O、8mM MgCl₂·6H₂O、10mM D-葡萄糖和10mM HEPES的细胞外溶液，用NaOH将pH值调整至7.4。使用钛宝石激光器（Integral OCT，FemtoLasers），其在820纳米左右有约120纳米的带宽，组织中结构成像的轴向分辨率提高到约2.5微米。横向分辨率（约4微米）、瑞利范围（约15微米）和神经上的光功率（约1毫瓦）与之前的实验相似。
在进行功能检测之前，通过在龙虾神经的宽度上横向扫描SD-OCT光束，获得了一个横截面图像（横向位置与深度）。在实时识别出神经纤维束后，将SD-OCT光束定位在纤维束中心附近的选定横向位置。图4A显示了龙虾神经的横截面图像，其中包含不同大小的多个神经纤维。箭头指向感兴趣的点，水平线对应于玻璃-生理盐水界面。这两个表面反射之间的相位差去除了共模噪声，并允许测量神经表面的纳米级位移。
图4. 在龙虾腿神经中AP传播的光学检测。（A）横截面SD-OCT图像显示了几个神经纤维。水平线对应于玻璃-生理盐水界面。（B）在AP期间，由于瞬态位移导致的图4A中上箭头所指示位置的光程长度变化，以及通过放置在光学读出区域前后的一对铂电极相对于地电位差分记录的相应复合AP。光学信号表示向参考玻璃表面方向的瞬态位移，并表明神经纤维的顶部表面朝膨胀方向移动。刺激（300μA，50μs）在2ms时呈现，并在电测量中产生一个局部伪影。（C）图4A中下箭头所指示深度位置的光程长度变化表示AP传播期间的位移，方向远离参考玻璃表面。（D）两个箭头所指示位置之间的光程长度增加表明，测量时可能不需要参考玻璃。每个轨迹平均了100个响应。
图4B显示了刺激时的电学和光学测量结果。以3.7刺激/秒的速率在2ms时施加的刺激脉冲（300μA，50μs）在电测量中产生了一个局部伪影。电信号的负峰和正峰分别表明AP到达第一个和第二个记录电极。因此，AP预计会在电信号的零交叉点附近到达光学测量区域。图4B中的光学测量显示了0.7纳米的快速瞬态光程长度变化，对应于图4A中上箭头所指示的神经纤维顶部表面约0.5纳米的实际位移。瞬态位移方向朝向参考玻璃表面。图4B清楚地表明，瞬态位移的开始时间和持续时间与AP高度相关。图4C显示了图4A中下箭头所指示的深度位置（神经纤维的底部表面）的光程长度变化。该信号在AP传播期间表示与图4B相似的瞬态位移，但方向相反。可以在这两个神经位置之间获得差分相位测量，而无需参考玻璃表面。图4D显示了这两个位置之间的光程长度增加结果。因此，龙虾神经中神经纤维的顶部和底部表面的同时测量表明，在AP传播期间，约1纳米的膨胀持续时间为1或2毫秒。为了提高信噪比，平均了100个位移轮廓。光学信号的前2ms的噪声标准差分别为0.16纳米、0.19纳米和0.23纳米，分别对应于图4B–D。电学和光学信号都具有5kHz的带宽。
四、讨论
光学测量的时间过程与在龙虾巨大轴突和乌贼巨大轴突中记录的纳米级表面位移的时间过程相似。这表明由于高轴向和横向分辨率，SD-OCT信号在特定深度可能源自一个或几个轴突。我们对龙虾和龙虾神经的位移幅度和持续时间与使用相同龙虾神经准备的早期报告相似。我们对龙虾神经的结果表明，在1或2毫秒的持续时间内，顶部和底部表面的位移约为0.5纳米，是从神经内部结构记录的，可能与另一项使用不同龙虾神经准备的研究报告不具有可比性，该报告称从更长且可能略微更厚的神经样本的顶部表面记录到约5纳米的膨胀，持续时间为10毫秒。
由于电学和光学信号是神经活动的不同标志，比较这些信号可能很困难。在我们的实验中，电学信号是由许多轴突（直径约1–50微米）产生的复合AP。尽管如此，电学和光学信号同时出现。乌贼巨大轴突可能是比较单个轴突的电学和光学信号时序的最佳模型。
文献中许多研究使用由两个交叉偏振器组成的装置测量相对光强变化（ΔI/I），而被研究的神经通常被放置在这些部件之间，与入射偏振态成45°角。在AP传播期间测量的光强变化可以被解释为神经中的延迟变化ΔR，ΔR=(1/2)R(ΔI/I)，通常被归因于双折射变化。双折射是许多生物结构（包括神经组织）共享的光学特性，它是光在平行和垂直于特定光轴方向偏振时折射率的差异。由于延迟R是双折射和样品厚度的乘积，样品厚度的变化也应该对延迟变化ΔR有贡献。事实上，如果假设乌贼巨大轴突的双折射（6.6×10⁻⁵）在AP传播期间保持不变，乌贼巨大轴突直径的1纳米厚度变化将使延迟改变0.066皮米。这个值比乌贼巨大轴突测量到的0.2皮米延迟变化小3倍，比轴突边缘测量到的0.56皮米延迟变化小8.5倍。仅由厚度变化引起的延迟变化可能太小，无法解释透射光强的变化；然而，厚度变化也预计会影响光散射特性，并相应地改变检测到的光强。神经纤维的瞬态厚度变化可能是神经活动内在信号的主要贡献者。
在反射模式几何结构中测量了交叉偏振光强，并且最近提出了一个基于几何光学的理论模型。在该模型中，交叉偏振基线强度和瞬态强度变化分别归因于轴突纤维的光反射和由于AP传播期间轴突膨胀导致的散射特性变化。尽管最近的报告表明了瞬态膨胀的作用，但仍需要进一步研究以了解光学信号和神经活动的机制。使用干涉仪已经报告了在活动期间神经纤维的膨胀以及有时的收缩，因此在不同情况下可能发生膨胀或收缩。此外，通过理解瞬态结构变化的机制，可以优化检测或增强这种光学信号的幅度。
SD-OCT技术可用于测量与神经活动直接相关的所有深度点的瞬态结构变化。SD-OCT技术的最新发展为功能和结构成像的临床应用迈出了重要一步。例如，在神经组织的特定深度处，也可以研究如光激活视网膜的缓慢反射率变化等强度测量。尽管在临床环境中，膨胀的小幅度和运动伪影构成了挑战，但神经内部位置之间的差分测量可能最小化轴向运动伪影，此外，为活体视网膜成像演示的主动反馈横向跟踪机制的进一步发展可能提供必要的横向稳定性。
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发布于 2025-08-06 17:50・广东
