PROTAC：借刀杀人

文章来源公众号：基因爱蛋白 作者：WENBIN

PROTAC借E3泛素连接酶清除靶蛋白。

细胞内的蛋白质并不是永久存在的，而是会被有控制地降解，尤其是那些错误折叠、受损或者不再需要的蛋白质。但在20世纪中期，科学界对于这一降解过程的机制几乎一无所知。

20世纪70年代至80年代，泛素被发现，随后泛素与蛋白质降解之间的关系被逐步揭示。这一重大发现也在2004年被授予诺贝尔化学奖。

20世纪90年代，随着对泛素-蛋白酶体系统研究的的不断深入，研究者意识到：如果细胞依赖蛋白酶体来降解那些被泛素化标记的蛋白质，那么通过抑制蛋白酶体的功能，就可以阻止“垃圾蛋白”或关键调控蛋白的降解，从而导致细胞周期阻滞，并最终触发细胞凋亡。

基于这一思路，研究者开发出了第一个相关药物——硼替佐米（Bortezomib）。它是一种蛋白酶体抑制剂（Proteasome Inhibitor），于2003年被美国FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma, MM）。经过20多年的发展，硼替佐米成为多发性骨髓瘤一线及后续治疗中的核心药物之一。

这一成功，证明了泛素-蛋白酶体系统作为药物靶点的巨大潜力。

泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）可以被拆解为两个主要环节：1、标记环节，由泛素分子与泛素酶系统完成；2、降解环节：由蛋白酶体完成。

如果我们把目光从“降解环节”移开，转而聚焦泛素介导的起始“标记环节”，会发现这一过程同样具有巨大的干预潜力与药物开发前景。

泛素-蛋白酶体系统是细胞内主要的蛋白质降解途径，负责细胞内80-90%的蛋白质降解。它不仅清除旧的、受损的、或错误折叠的蛋白质，还调控细胞周期、信号转导、基因表达、应激响应等多种细胞过程。

其中泛素分子是一种由 76 个氨基酸组成的小分子蛋白质，广泛存在于真核细胞中。通过共价结合，标记、待降解的靶蛋白，给蛋白质贴上 “待销毁” 的标签。

而将泛素分子连接到靶蛋白上的工作由泛素化酶系统完成，包括E1激活酶，E2结合酶，E3连接酶等三种关键酶。其中E1，E2具有普适性，人类细胞中仅两种E1，大约有40种E2。E3具有特异性，多达600种，能结合多种底物。

在靶蛋白的泛素化过程中，E1通过消耗 ATP，结合泛素分子，形成高能硫酯键，将泛素分子激活。激活的泛素从 E1 转移到 E2 的活性位点，形成 E2-泛素复合物。E3 可以特异性识别靶蛋白和 E2-泛素复合物，催化泛素转移到靶蛋白的一个赖氨酸上，形成 第一个、泛素-靶蛋白、异肽键，称之为单泛素化。如果泛素化信号持续存在，E3 可以继续识别这个已被泛素化的靶蛋白，新的泛素分子会被连接到第一个泛素分子的某个赖氨酸残基，经过多次反应，多个泛素分子一个接一个地连接起来，形成一条多泛素链。在通常情况下，会形成一条由四个泛素分子连接的四泛素链。

泛素分子本身有 7 个赖氨酸残基（Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48、Lys63）和 1 个 N 端甲硫氨酸 ，它们都可以作为连接位点，形成不同类型的泛素链。其中K48连接是泛素化降解的重要形式。

泛素结构

靶蛋白被多泛素化标记之后，会被蛋白酶体识别，去除泛素链，并通过 20S 核心颗粒的蛋白酶活性将靶蛋白降解为短肽，短肽随后被进一步分解为氨基酸，重新用于蛋白质合成。

由此，细胞通过泛素化过程完成了对靶蛋白的降解。这一天然存在的过程，成了药物开发的切入点。

蛋白降解剂（Protein Degraders） 是一类通过靶向、并诱导致病蛋白（如癌蛋白、转录因子等）， 被细胞内天然降解系统清除的新型药物。它们代表着小分子药物开发领域的一次重要范式转变，将传统药物的“抑制”功能，转变成“清除”功能。

目前最主流的蛋白降解技术包括：

蛋白水解靶向嵌合体（Proteolysis-Targeting Chimeras, PROTACs），

分子胶降解剂（Molecular Glues），

溶酶体靶向嵌合体（Lysosome-Targeting Chimeras, LYTACs） 等大类，PROTAC还细化出靶蛋白配体为大分子型（类似ADC药物）、小分子型。

其中以PROTAC和分子胶最为成熟。

分子胶（Molecular Glues)，顾名思义，是将两个分子粘在一起的“胶水”，这两个分子是E3连接酶和目标靶蛋白。

E3连接酶和目标靶蛋白连接之后，将泛素转移到目标靶蛋白，进而被蛋白酶体识别并降解。

分子胶作用机理，和PROTAC类似

分子胶的分子量较小，为单功能小分子。目前已经清楚的靶点主要是转录因子（IKZF1/IKZF3），属于多发性骨髓瘤的驱动基因。而转录因子IKZF1/IKZF3依赖E3泛素连接酶降解，而CRBN恰好是组成该E3酶的结构单元，刚好被来那度胺（分子胶）结合。因此，来那度胺通过诱导CRBN E3泛素连接酶和转录因子（IKZF1/IKZF3）结合而诱导转录因子被蛋白酶体降解。但来那度胺，最早作为免疫调节剂开发，但后来被证明其分子机制属于分子胶。

来那度胺连接CRBN和CK1α，促进CK1α的泛素化降解

其他如沙利度胺（Thalidomide），泊马度胺（Pomalidomide）都属于分子胶机制。

几个成功的分子胶药物，都是小分子，来那度胺，沙利度胺，泊马度安

分子胶技术的多元化程度较低，许多化合物是早期发现的，新产品管线较少，而PROTAC是目前研究和产业化推进最为前沿的技术平台。

PROTAC的原理类似分子胶，连接E3泛素连接酶和靶蛋白。但分子胶是单分子，PROTAC是有三个小分子合成的新化合物，分别是：

靶蛋白配体（Targeting Ligand, Protein of Interest Ligand, POI）：负责与致病蛋白结合；

E3泛素连接酶配体（E3 Ligase Ligand） ：与细胞内的E3泛素连接酶结合；

连接子（Linker） ：连接上述两个配体。

这三部分组成了一个新的化合物分子，相比分子胶，该结构展现出更强的可塑性优势。

PROTAC结构

靶蛋白配体是 PROTAC 的 “靶向端”,直接结合想要降解的目标蛋白。靶蛋白配体通常来源于已知的小分子抑制剂、天然配体等。【比如雄激素受体（AR）的配体常采用恩杂鲁胺类似物；雌激素受体（ER）则采用他莫昔芬类似物；BTK（布鲁顿蛋白激酶）则采用伊布替尼结构类似物】。

倘若靶蛋白缺少传统小分子结合位点，配体的设计难度依然很大，比如许多转录因子，支架蛋白等。

E3泛素连接酶是PROTAC成药的关键，虽然人体中有600多种E3泛素连接酶，但并非所有的 E3都适合成药。目前，能成药的E3连接酶少之又少，约只有1%左右。主要包括：

1. CRBN：

2. VHL

其他E3连接酶如IAPs（Inhibitor of Apoptosis Proteins，凋亡抑制蛋白家族）；靶蛋白为凋亡相关蛋白，如BCL2，NF-κB通路相关因子；MDM2，靶蛋白为p53。

连接子是PROTAC的“结构桥梁”，连接子的设计多采用烷基链（-(CH₂)ₙ-，如PEG链）或刚性放芳环（苯环、哌嗪、三唑环），连接了“靶蛋白配体”和“E3泛素连接酶配体” ，他决定了PROTAC 分子的整体构象。其目的是让PROTAC、靶蛋白、E3连接酶形成稳定的三元复合物。但可能会只形成PROTAC和靶蛋白或E3连接酶的二元复合物，而影响药物效率。

一些PROTAC分子的结构

PROTAC的药物设计，有科学性，似乎也有点玄学和艺术性。

PROTAC的作用机理可拆分成四个步骤：

1、PROTAC 分子同时结合靶蛋白和E3泛素连接酶；

2、诱导形成靶蛋白-E3连接酶-PROTAC三元复合物；

3、E3连接酶介导靶蛋白的泛素化；

4、泛素化的靶蛋白被26S蛋白酶体识别并降解；

PROTAC作用机理

相比于小分子抑制剂，理论上，PROTAC有许多优势：

1、剂量较低：

小分子药物主要通过“占据催化位点”抑制靶蛋白作用，一个靶蛋白需要一个分子，给药剂量更高；

PROTAC分子可以重复利用，降解一个靶蛋白之后，PROTAC分子会被释放并参与降解下一个靶蛋白，给药剂量低；

2、可使靶蛋白丧失全部功能：

小分子药物主要使靶蛋白失去催化功能，但其非催化功能依然保留；

PROTAC分子可使靶蛋白完全被降解；

3、选择性高：

部分小分子药物选择性不佳，可结合并抑制多种蛋白，副作用较大；

PROTAC与靶蛋白、E3连接酶、形成三元复合体，对靶蛋白具有高度选择性，可特异性的降解靶蛋白；

4、克服耐药：

小分子药物在治疗过程中，常常出现突变耐药，需重新针对激活后的构象设计药物；

PROTAC无需兼顾耐药突变的出现，可降解多种耐药突变蛋白。

在众多PROTAC药物中，ARV-471是光环最多的一个，也是第一个走到临床三期的PROTAC药物。

ARV-471结构

ARV-471由ARVINAS公司开发，公司的使命是通过PROTAC技术治疗重大疾病，改善患者生存。公司创立于2013年，创始人为Craig M. Crews 博士，于2001年最早提出 PROTAC 概念。

ARVINAS公司官网首页

依托PROTAC技术平台，ARVINAS开发了多种药物，集中在『肿瘤』和『神经系统』疾病两大方向，其中『肿瘤』领域，针对乳腺癌，靶向ER的药物ARV-471，针对前列腺癌，靶向AR的药物AR-110、ARV-766。公司多条产品线与辉瑞、诺华、拜耳等药企合作，其中ARV-471（Vepdegestrant）与辉瑞合作，已有临床三期结果。

ARVINAS公司产品线及临床进展

VERITAC-2临床研究（NCT05654623）结果显示，在ESR1突变人群(n=270)中，与氟维司群相比，ARV-471（Vepdegestrant）治疗可显著延长无进展生存期(PFS)，且具有统计学意义和临床意义(风险比[HR]，0.57 [95% CI, 0.42-0.77]；P < 0.001)。ARV-471（Vepdegestrant）组的中位PFS为5.0个月(95% CI, 3.7-7.4)，而氟维司群组为2.1个月(95% CI, 1.9-3.5)。

但在所有患者中（n=624)，PFS的改善均未达到统计学意义(HR，0.83 [95% CI, 0.68-1.02]；P =0 .07)。ARV-471（Vepdegestrant）组的中位无进展生存期(PFS)为3.7个月(95% CI, 3.6-5.3)，氟维司群组为3.6个月(95% CI, 2.2-3.8)。

辉瑞和ARVINAS向FDA提交了临床申请，8月8日，FDA已接受ARV-471（Vepdegestrant）新药申请的审查，用于治疗先前接受过内分泌治疗的(ER+)/(HER2-)、且ESR1突变的晚期或转移性乳腺癌患者。