研究表明，神经元在动作电位作用下会发生亚纳米级的快速形变，这使得离散轴突和突触去极化过程的光学记录成为可能。这种光学测量的形变现象为神经活动记录提供了全新表征方式。我们通过全息光学相位记录技术，在群体神经元层面实现了快速形变的活体测量，证实该表征方式可拓展至活体研究。本系统首次实现了包括穿颅检测在内的、与群体神经元活动相关的活体组织形变无创记录。研究团队在多种神经激活模型中验证了该技术，包括硬膜外局部电刺激、麻醉诱导的皮层抑制、触须桶刺激引发的初级体感皮层激活，以及药物诱导癫痫发作。研究表明，全息成像技术为深部跨颅神经活体活动提供了高分辨率、无标记、无创的记录途径，对神经功能和信号传导研究具有显著优势。
一、介绍
高分辨率、无创的神经活动记录一直是临床和研究神经科学的目标，以更好地理解人类认知功能并改善神经治疗。尽管已有多种技术被用于无创记录和绘制神经信号，但目前仍缺乏一种能在动态活体模型中匹配轴突和突触去极化离散现象的空间和时间分辨率的技术。电生理记录长期以来被视为金标准，能够通过电极（如皮层脑电图、电极对或膜片钳技术）从单神经元到群体神经元层面进行侵入式记录。然而，非接触、无标记的方法具有避免神经组织损伤以及提供更高记录灵活性的优势。
数十年来，光学记录已成功检测到伴随神经元激活的变化，表明光子学方法可能适用于非接触、无标记的神经活动检测与成像。许多研究探索了与神经激活相关的固有光学变化，包括组织反射率或强度的改变以及偏振变化。另一种实现该目标的有前景的方法是直接测量动作电位期间的神经元形变。研究人员通过信号平均技术记录了电活性细胞中动作电位诱导的全场形变。这些工作表明，成功记录此类形变需要具备亚纳米位移灵敏度和亚毫秒时间分辨率的高空间分辨率成像系统。近期研究利用干涉测量和相干光学方法检测这些位移信号，因为基于相位的测量具有高灵敏度，能够揭示组织动力学（如形变）。其他非干涉测量的相干光学方法（如激光散斑成像）无法恢复相位信息，因而不能量化组织形变，而是通过统计散斑强度在时空上的变化来推导组织动力学，使其广泛应用于血流相关变化的观察。
基于相位的测量已成功在体外培养细胞和离体鱿鱼巨轴突中实现，结果表明组织动力学与神经活动的电生理记录高度相关。然而，将这些光学相位方法拓展至活体模型具有挑战性，主要由于活体组织固有的动态特性会引入更强的生理噪声和光学相位噪声。例如，呼吸和血流产生的生理噪声显著，且相关组织位移远大于神经活动信号。此外，组织散射体的非相关运动（如微血管运动）导致的光学相位噪声进一步增加了记录难度。相位噪声限制了测量灵敏度，影响了对神经元活动相关纳米级位移的检测能力。体外样本的去相关时间在秒量级，而活体样本则在毫秒量级，这大幅增加了记录挑战。
我们的研究致力于开发全场数字全息成像（DHI）系统，该系统通过抑制生理噪声并最小化光学相位噪声，实现了活体跨颅无创检测群体水平皮层神经活动。我们采用三种机制不同的神经激活模型验证该技术：硬膜外局部电刺激（FES）、触须偏转诱导的初级体感皮层固有激活，以及从麻醉状态到皮层癫痫发作的药物性神经活动调控。这是首次在活体实验中实现皮层活动的光学相位检测，通过颅窗制备和完整颅骨深部成像，展示了群体水平神经激活的时空动态过程。
二、用于活体神经活动记录的数字全息成像技术
本研究的DHI系统能以高灵敏度持续测量组织纳米级的离面形变，为群体神经元活动检测提供了新方法。光学系统由干涉仪构成，采用相干光源照射目标皮层区域（图1a）。在离轴全息配置中，皮层散射光与源自同一光源的参考光束在焦平面阵列（FPA）发生相干混频，形成的干涉图样（即全息图）可通过数字处理反推组织形变。（详见材料与方法部分关于DHI系统的说明）
组织形变计算是一个多步骤过程：首先对全息图进行直流项滤波，随后通过菲涅尔变换将波前数值传播至皮层深度（图1b）。生成的图像（h）包含采样区域的幅值与相位信息，其采集速率超过1.5 kHz——该速率既能适应皮层组织毫秒级去相关时间以抑制光学相位噪声，又能确保组织在帧间产生可测量的位移。相位信息随后用于计算感兴趣区域（ROI）内的平均速度或位移，并通过像素间非相关相位噪声的校正来降低误差，最终实现纳米级帧间位移解析。空间平均处理首先通过计算两幅连续图像的互相关完成，公式表示为：
其中x和t分别表示空间和时间维度，*表示复共轭运算。感兴趣区域（ROI）内的平均相位变化由以下公式给出：
其中〈·〉x 表示对χ的实部和虚部分量分别进行独立平均。随后通过将相位变化量（Δϕ）除以光源波长（λ）与采样时间间隔（Δt），即可计算出组织运动速度，其表达式为：
相应的位移量通过数值积分速度得到。这种在复数域定义的空间平均具有双重优势：首先，基于像素的相位变化会由两幅图像的幅度乘积进行加权，从而降低因低幅值导致的高相位噪声权重；其次，与实数域的相位平均不同，复数域平均可避免2π相位缠绕问题。
我们构建了两套工作波长分别为780 nm和1310 nm的DHI系统。较短波长的780 nm系统具有更高速度灵敏度，被用于验证系统性能的初期实验；而1310 nm系统则通过降低光散射引起的光子传播损耗，显著提升了深部探测能力——这对跨颅测量至关重要。由于本方法通过检测组织运动而非血流动力学响应来记录神经活动，光学系统对神经活动的灵敏度基本不受波长影响（参见补充材料图S1）。两套系统的固有空间分辨率均设计为30 μm，深度分辨率则通过短相干长度激光实现：780 nm系统采用3 mm相干长度激光（深度分辨率约1 mm），1310 nm系统采用50 μm相干长度激光（深度分辨率约16 mm，已考虑系统双程光路和组织折射率）。通过参考臂的光程延迟线可调控相干门轴向位置，确保探测区域覆盖神经活动区以优化记录灵敏度。
我们通过系列实验验证了该方法：首先利用硬膜外局部电刺激（FES）模型——因其明确的时空响应特性——在完整硬脑膜条件下进行记录。FES单次激发记录的成功促使我们进一步开展跨颅测量以验证深部探测能力。其次，通过触须机械偏转触发丘脑-皮层传出通路，检测初级体感皮层桶区（wS1）的内源性诱发响应。最后，测量了三种皮层激活状态（麻醉状态、正常状态和癫痫发作期）下的组织形变，其中癫痫活动用于表征更大空间范围的同步神经激活。实验结果既呈现了单次刺激事件的组织形变，也采用刺激锁定平均（SLA）技术降低噪声，并同步记录电生理信号进行对照。
图1.数字全息成像（DHI）系统概述、图像重建及速度计算。 （a）DHI系统示意图。 L=透镜，PBS=偏振分束器，BS=分束器，M=反射镜，HWP=半波片，LP=线性偏振片。准直激光入射到PBS上。反射光束通过透镜系统照射样品，在PBS后形成图像。参考光束直接透过PBS，进入可变长度延迟线，并通过10/90分束器与物光结合。相机📷️FPA记录全息图。 （b）计算目标速度的重建流程概述，对全息图进行傅里叶变换（FFT）转换到k空间，并在截止频率（虚线）处滤波以抑制直流项。通过应用逆傅里叶变换（IFFT）和菲涅尔变换（FrT）重建包含幅值和相位信息的复图像，随后裁剪至包含实像的区域（虚线）。计算时间序列点之间的互相关图像（无空间位移），并定义处理感兴趣区域（ROI）。通过空间平均ROI内的复像素，并利用波长（λ）和采样间隔（Δt）将弧度值转换为速度单位，计算ROI内的平均速度。
三、结果
01.神经活动相关的组织形变受FES电流调控
最初的FES测量采用780nm DHI系统和3mm相干长度激光完成。实验在麻醉、肌松和机械通气的Sprague-Dawley大鼠(350-450g)半颅骨切除术后进行，将一对钨刺激电极置于暴露的硬膜外表面(图2a,b)。采用硬膜外(而非硬膜下)刺激以最大限度减少皮层组织损伤。通过恒流隔离脉冲刺激器以0.25mA、0.50mA和0.75mA电流进行10Hz重复阴极双极刺激[0.125mm硬膜外接触点]，并通过DHI记录神经响应。
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从阴极附近0.5mm ROI提取的速度波形显示，在每次刺激脉冲开始后5ms内即可检测到与诱发神经活动相关的组织速度变化(图2c)。在0.50mA和0.75mA较高电流下，单次刺激水平即可观察到响应，而0.25mA时需要进行刺激锁定平均(SLA，n=30次事件)以降低速度噪声。FES后10ms内通过SLA(n=30次事件)速度均方根(RMS)量化的组织速度空间分布显示，激活区域随电流增大而扩大(图2d)。在阴极附近0.5mm ROI内，刺激后10ms RMS速度量化的相应激活幅度随刺激电流显著增加(p<0.05；图2e,f)，大多数RMS速度值在5-100μm/s范围内。比较单个大鼠(图2e)与多只大鼠(图2f)的RMS速度，不同刺激电流间的RMS速度值存在更多重叠。
图2.局部硬膜外电刺激（FES）后的皮层组织速度响应（a）FES实验大鼠示意图，显示置于硬脑膜表面的电极位置（b）皮层平均幅值图像，蓝色线表示电极位置，白色虚线圆圈标定用于速度波形分析的ROI区域。比例尺：0.5 mm（c）不同FES电流下的速度波形图：（上）0.25 mA，（中）0.50 mA，（下）0.75 mA，蓝色三角标记刺激起始时刻。插图为经刺激锁定平均（SLA，n=30次事件；黑线）处理后的速度波形（d）FES后10ms内SLA（n=30次事件）的均方根（RMS）速度分布图：（上）0.25 mA，（中）0.50 mA，（下）0.75 mA，采用0.5 mm直径滑动窗口计算。半透明叠加的背景为平均幅值图像（e）图C/D所示单个大鼠FES后10ms内的RMS速度（n=30次）（f）多只大鼠的RMS速度统计（0.25 mA：6只大鼠共617次刺激；0.50 mA：11只大鼠共1,118次刺激；0.75 mA：7只大鼠共1,160次刺激）。箱线图显示中位数（黑线）、25%-75%四分位距（灰色箱体）、非异常值极值（须线）以及定义为1.5倍四分位距外的异常值（黑点）。*p<0.05（Kruskal-Wallis检验，经Dunn-Šidák多重比较校正）（g）异氟烷、（h）利多卡因给药后及（i）心脏停搏诱导后10ms内的RMS速度。数据点为均值（黑点）±标准差（n=30次FES事件）。*p<0.05（单因素ANOVA，经Dunn-Šidák多重比较校正）
02.FES生物学验证
通过针对性对照实验，我们证实了神经元激活相关组织速度变化的来源。
03.麻醉性皮层抑制
采用异氟烷全身麻醉实现直接皮层神经元抑制。这种卤代醚通过抑制多种离子通道活性，广泛阻遏神经元和轴突活动（包括自发性皮层活动和传入诱发电位）。与0%异氟烷基线相比，麻醉后刺激RMS速度呈现显著剂量依赖性降低（p<0.05；图2g）。
在另一种麻醉模型中，局部应用钠通道阻滞剂利多卡因（4%）可有效抑制轴突传导。与麻醉前基线相比，FES诱导的组织速度变化能力显著减弱（RMS速度显著下降，p<0.05；图2h），该抑制效应与利多卡因局部麻醉的已知持续时间相符。
04.心脏停搏后
循环衰竭后，神经元功能呈时间依赖性衰退。外源刺激应引发递减响应。FES刺激期间的RMS速度确实显示显著低于基线的递减响应（p<0.05；图2i）。
05.内源性皮层刺激诱发神经形变响应
将光学记录技术拓展至内源性诱发皮层活动模型，验证该方法对固有皮层刺激范式的适用性。
06.触须桶皮层激活
在首个诱发活动模型中，我们测量了单根触须偏转后初级体感桶皮层（wS1）的组织速度（图3a）。采用1310nm光学系统（3mm激光相干长度）进行检测，并通过透明皮层脑电（ECoG）网格同步记录神经活动（图3b）。对速度数据施加高通滤波以消除血流/呼吸等生理性低频干扰，同时计算ECoG数据的高伽马频段进行光学-电信号频域对比。经SLA处理（n=50次事件）显示，ECoG与组织速度的起始时间（约10ms）和持续时间（约50ms）高度同步（图3c,d）。5只大鼠的SLA分析（n=30次事件）表明刺激前后RMS速度存在显著差异（p<0.05；图3e），其中4只大鼠在非SLA条件下仍保持显著差异（p<0.05；图3f）。wS1区速度变化范围约0.2-8μm/s。
07.皮层癫痫发作
采用GABA拮抗剂青霉素局部给药诱发棘波癫痫模型，建立第二种自然诱发神经活动范式。780nm光学系统记录显示，皮层应用青霉素后自发性EEG尖波/棘波（75-250µV）与组织速度波动（±500μm/s）同步出现（图3g），其中高幅爆破性EEG尖波与速度信号的相关性尤为显著。
图3.与内源性诱发神经活动相关的皮层组织速度。 （a）单根触须偏转刺激及初级桶状皮层（wS1）成像的大鼠实验装置 （b）覆盖硬膜外ECoG网格的wS1幅值图像。比例尺：0.5 mm （c）经SLA处理的速度信号（n=50次刺激；蓝色）及对应的（d）希尔伯特包络（蓝色），与（b）中白箭头所示电极记录的ECoG波形（n=50次刺激；红色）叠加显示 （e）5只大鼠刺激前25 ms（浅灰）与刺激后25 ms（深灰）的SLA-RMS速度统计（R1：n=9次；R2：n=3次；R3：n=7次；R4：n=21次；R5：n=13次）。箱线图中每个数据点基于30次刺激锁定事件计算 （f）对应5只大鼠未进行事件平均的刺激前后RMS速度（R1：n=296次；R2：n=99次；R3：n=210次；R4：n=634次；R5：n=399次）。*p<0.05（Mann-Whitney U检验） （g）青霉素诱导癫痫模型的速度（蓝色）与EEG（红色）波形对比：给药前、给药后4分钟、15分钟和16分钟记录。（g）插图为同步记录的心电图（ECG；橙色）波形
08.DHI对FES诱导神经形变的检测能力在完整颅骨条件下保持稳定
采用皮层激活FES模型评估系统跨颅测量组织速度的灵敏度。该模型中，电极通过完整颅骨上2 mm钻孔（图4a,b）与硬脑膜接触，在未覆盖钻孔区域的0.5 mm ROI内评估组织速度。为消除深部成像时光散射效应，对SLA前（n=30次事件）的分段速度数据进行刺激前Z-score标准化。本实验选用1310 nm DHI系统配合50 μm相干长度激光，分别提升深部检测灵敏度与深度分辨率（详见补充材料）。短相干长度带来的灵敏度提升源于探测区域与神经活动体积的优化重叠（补充材料图S2）。
RMS速度分布图显示系统可在约2.0 mm深度（对应皮层表面）定位神经活动（图4c），刺激后10 ms内RMS速度值较刺激前均值高出约6个标准差。2.0 mm深度处SLA速度信号的时域响应显示：刺激后起始延迟<5 ms，持续10 ms（图4d），与暴露皮层测得的光学响应（图2b插图）相似。相比之下，颅骨、硬脑膜及蛛网膜下腔等浅表区域的RMS速度响应仅较基线升高<2个标准差（图4e）。上述不同深度的记录通过调节DHI系统参考臂光延迟线改变相干门位置实现。
图4.跨颅FES诱导的皮层组织速度响应 （a）大鼠实验示意图显示0.75 mA FES刺激下经颅骨放置的电极配置 （b）皮层平均幅值图像：蓝色线标示通过颅骨钻孔（红色虚线圆圈标记边界）与硬脑膜接触的电极位置，白色虚线圆圈划定ROI区域（用于d/e图速度波形分析） （c）不同成像深度（-0.3至3 mm，左至右）的FES后RMS速度分布图（SLA处理，n=30次事件，经刺激前Z-score标准化）。采用0.5 mm直径滑动窗口计算，半透明叠加于速度图上的背景为平均幅值图像。比例尺：0.5 mm （d）特定深度（见e图标注）的刺激前Z-score标准化速度波形（SLA处理，n=30次事件），垂直虚线标记FES起始时刻 （e）对应（b）图ROI区域的RMS深度分布（SLA处理，n=30次，经刺激前Z-score标准化），灰色区域标注主要解剖层次深度范围（深度值相对于颅骨表面）
09.不同神经刺激模型下的组织形变差异
为比较不同神经刺激模型引发的组织形变，我们计算了刺激后的总组织位移量。结果显示组织位移中位数范围从wS1激活时的6.7 nm到癫痫发作放电时的5.9 μm不等（图5）。在FES模型中，0.25 mA、0.5 mA和0.75 mA刺激电流对应的中位位移量分别为91.2 nm、140.9 nm和190.2 nm。各模型间的位移差异均具有统计学显著性（p<0.05）。
图5.多种神经刺激模式下的组织总位移量。wS1：n=1638次 FES 0.25 mA：n=617次 FES 0.50 mA：n=1,118次 FES 0.75 mA：n=1,160次 癫痫放电：n=20次
*p<0.05（Kruskal-Wallis检验，经Dunn-Šidák多重比较校正）
四、讨论
研究结果证实，DHI系统能有效解析与神经活动直接相关的组织形变特征，这些发现通过多种精确测量形变时空特性的刺激范式得到验证。
实验首先采用硬膜外FES刺激完整硬脑膜下的皮层神经元，因其能提供最直接的神经激活模型。该FES方案实现了神经元群体的可重复同步激活。在0.5 mA和0.75 mA刺激电流下，我们观察到单次刺激即可检测神经组织形变（通过速度量化），证明这种形变信号可与非突触生理过程或系统固有噪声区分。当电流降至0.25 mA时，需采用SLA技术抑制噪声干扰以准确捕捉神经活动诱发的皮层形变。空间速度分布图（图2d）显示形变主要集中于阴极附近，支持阳极刺激更易激活轴突而非胞体或末梢的特征。形变空间范围随刺激电流（0.25-0.75 mA）从0.1 mm扩展至0.5 mm，并在约2-3 ms内从阴极径向传播（图2d），该时空特征与活体电流扩散理论预测高度一致。根据Stoney等建立的哺乳动物皮层电流-兴奋半径关系，我们推算出0.25/0.50/0.75 mA电流对应的有效兴奋半径分别为0.44/0.62/0.76 mm。这些发现表明，DHI检测到的是神经元群体的机械响应总和，且募集范围随刺激电流增大而扩展（图2d,e）。但由于系统探测深度（约1 mm，取决于光源相干长度）大于典型神经元激活层厚度，在径向对称激活假设下会导致响应信号模糊。未来通过缩短相干门可减小探测体积以提升分辨率。
硬膜外FES诱导的皮层运动还受神经生理状态调控。全身性（异氟烷）与局部（4%利多卡因）麻醉均导致组织速度下降（图2g,h），证实抑制神经元去极化会减弱群体组织运动。异氟烷浓度依赖的速度递减进一步表明该信号可反映去极化神经元数量。局部利多卡因约10分钟的药效持续时间与离子电渗给药研究高度吻合。心脏停搏模型中，随着EEG证实神经元活性逐渐丧失，速度信号也呈现同步衰减（图2i），强化了组织形变与神经元去极化的定量关联。需指出，神经元去极化同步性等因素可能影响测量结果，但现有数据尚不足以得出明确结论，这有待未来研究阐明。
除记录硬膜外FES诱导的表层皮层响应外，我们还探索了中等深度神经活动的检测。通过完整颅骨进行硬膜外FES实验（图4），系统在1310nm波长（降低光散射）和50μm相干长度（提升深度分辨率）参数下，实现了高时空分辨率的跨颅测量。深度扫描显示最大神经组织形变出现在颅骨表面下约2mm的皮层预估位置，但与硬膜外FES不同，形变峰值集中于阴阳极之间。这种差异源于DHI系统与皮层表面的相对取向偏差导致探测体积不完全平行于皮层，同时硬膜外FES优先激活表层神经元的特点也限制了对更深神经组织的表征。未来需采用深部电极FES进一步评估DHI的穿透能力。尽管如此，该结果已证实DHI通过散射组织实现无创、无标记神经活动检测的可行性，克服了电生理或荧光成像的侵入性需求。
为拓展DHI的活体应用场景，我们从FES直接激活转向触须偏转和癫痫发作的内源性皮层激活研究。触须桶皮层（wS1）的单触须刺激实验显示，组织形变的起始时间和持续时间与同步记录的ECoG信号高度一致（图3c），但速度幅值显著低于FES诱导值。为有效提取这些微弱信号，我们采用100Hz截止频率的高通滤波抑制生理伪迹，并结合SLA降低生理噪声与组织相位噪声。需注意的是，SLA处理会同时降低刺激前后速度值，但对刺激后速度的影响程度较小，表明其变异度高于FES诱导响应。这种差异源于wS1的特殊结构与功能：不同于FES的直接同步激活，触须刺激通过丘脑-皮层通路逐级传递至wS1，而约1mm的探测深度导致跨层神经传播的形变信号模糊。未来采用更短相干长度激光逐层成像将提升wS1形变图谱精度。尽管如此，多组动物实验仍证实刺激前后速度存在显著差异（图3e,f）。为补充另一种神经激活模式，我们采用癫痫模型研究大范围同步激活的形变特征，发现发作期形变与EEG信号高度同步（图3g），其速度幅值远超FES和触须刺激，这归因于探测体积内大量神经元的同步募集。
综合研究结果表明，活体神经活动相关的皮层组织形变特征取决于神经激活模式与强度。本研究虽以速度参数为主要分析指标，但为与既往离体研究对照，我们同时计算了刺激事件中的组织总位移量（图5）。与速度变化趋势一致：触须刺激引发的位移最小（中位数6.7 nm），FES刺激呈电流依赖性递增（0.25/0.5/0.75 mA对应91.2/140.9/190.2 nm），癫痫放电则产生最大位移（达5.9 μm）。相较于离体研究中观察到的纳米级神经元位移，活体测量值显著更大。这种差异源于群体神经元响应受多种因素影响，包括神经元数量密度与空间排列、激活同步性以及细胞外基质力学特性等。如Peets等综述所述，虽然单神经元电机械耦合模型已取得重要进展，但建立神经群体尺度模型对理解宏观组织形变的物理机制至关重要。
这些发现为脑功能光学检测开辟了新途径：DHI神经形变测量技术以其无标记、高时空分辨的特性，既能与现有技术形成互补，又具备基础研究与临床应用的巨大潜力。
五、材料与方法
01.实验动物
采用Sprague-Dawley雄性大鼠（325-450 g），所有实验程序经约翰霍普金斯大学动物护理使用委员会（IACUC）及陆军动物护理使用审查办公室（ACURO）批准，符合ARRIVE指南规范。
02.动物准备
大鼠经面罩吸入1%异氟烷诱导麻醉后，行股动静脉插管。气管切开术后，除完整颅骨成像组外均实施右侧颅骨切除术暴露额顶叶硬脑膜。完整颅骨组则去除右半球头皮至骨膜层，并在体感皮层区钻两个间距1 mm的骨孔（直径300 μm）放置刺激电极。手术完成后固定于立体定位仪，连接呼吸机维持氧饱和度（92-100%）及呼气末二氧化碳（30-45 mmHg）。麻醉维持采用腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）与右美托咪定（0.15 mg/kg），根据心率血压变化追加剂量（25 mg/kg氯胺酮与0.1 mg/kg右美托咪定）。肌松维持使用罗库溴铵（7.5 mg/kg/h）。全程实时监测生命体征，包括光电体积描记（PPG）、呼气末二氧化碳（EtCO2）、心电图（ECG）及动脉血压（采样率1.25 kHz），加热垫维持体温37℃。实验结束后静脉注射戊巴比妥（10 mg/kg）实施安乐死。
03.局部硬膜外电刺激（FES）
FES（250-750 μA）作为主要神经激活方法。采用绝缘单管钨刺激电极对（裸露尖端<0.25 mm），定位在硬脑膜表面（前囟后4 mm，中线旁开4 mm，右半球），电极间距约1 mm。操作时确保电极尖端最小化硬脑膜损伤，并保持适度张力以维持稳定接触。恒流隔离脉冲刺激器（A-M Systems 2100型）输出阴极双相刺激，典型参数为：峰值电流250-750 μA，脉宽5 ms，频率10 Hz，持续1-3秒。
皮层电压变化通过绝缘不锈钢双极记录电极对（置于顶叶硬脑膜表面）监测，由EEG100C系统记录。相机📷️帧信号与事件触发TTL脉冲同步录入Biopac系统，采样率20 kHz。
04.药理学对照实验
全身麻醉对照组采用异氟烷（0.5-3%），通过呼吸机配套挥发罐（GE Datex Ohmeda TEC 5）给药。每个浓度维持至少5分钟后进行下一组FES刺激。局部麻醉实验中，将4%利多卡因（50 μL）注射至刺激电极邻近的硬膜外表面，5分钟后清除。所有FES对照实验均通过皮层脑电监测麻醉剂效应。
05.触须刺激实验
wS1皮层诱发响应实验中，采用32通道透明电极阵列同步采集硬膜外ECoG、DHI及Biopac数据。阵列含铂电极（直径100 μm，间距600 μm），集成于20 μm厚透明聚合物基底。ECoG数据通过SmartBox Pro系统以30 kHz采样。触须偏转通过自制机械臂实现，以1.5 Hz频率进行头尾向偏转，每次持续10秒。实验前修剪目标触须至1.5 cm，其余触须剪至须垫水平。ECoG定位wS1对应桶区后，调整体位实现ECoG与DHI同步记录，确保仅目标触须受刺激。
06.癫痫模型
动物准备流程与FES实验相似，但无需放置刺激电极。硬膜外置入双极记录电极对（间距0.5 mm）后，先采集基线数据，再局部应用青霉素（6000单位溶于50 μL生理盐水，1.0 mm直径液滴）于硬脑膜表面。间歇性采集DHI数据以捕捉发作期与间期活动。
07.数字全息成像系统（DHI）
所有光学数据均采用离轴配置的DHI系统采集，该系统设计用于测量反射几何模式下样品的空间分辨相位变化。激光被分束至参考臂和样品臂，一束3毫米直径的准直光束以皮肤安全功率垂直照射样品。从样品散射的光被收集并通过远心透镜系统传递，在相机📷️前方75毫米处形成图像。该光随后通过分束器与参考光束混合，形成传统的离轴全息图。参考臂包含一个光学延迟线，通过调节其长度使参考臂光程与目标成像深度的样品臂光程匹配。采用标准菲涅尔图像重建方法获取复图像信息，参考光束的角度设计使得3毫米直径光束照射的样品区域在重建图像空间中单独成像，与自相关项空间分离。
对于780纳米DHI系统，全息图使用Genie Nano相机📷️采集。相机📷️以256×256像素的焦平面阵列（FPA）工作，帧率为1550赫兹。重建图像的空间分辨率约为30微米，这是基于FPA到远心透镜成像面的距离为50毫米以及相机📷️像素间距为4.8微米计算得出。780纳米激光器的相干长度为3毫米，根据组织折射率（假设为1.34）计算得到的深度分辨率约为1毫米。
对于1310纳米DHI系统，全息图使用CRED3相机📷️采集。相机📷️以256×256像素的FPA工作，帧率为1980赫兹。重建图像的空间分辨率为30微米，这是基于FPA到远心透镜成像面的距离为90毫米以及相机📷️像素间距为15微米计算得出。1310纳米激光器的相干长度为50微米，对应的深度分辨率约为16微米。
通过测量硬目标并计算宽带功率谱密度（PSD）确定了光学系统的本征相位或速度灵敏度。该本征相位灵敏度受多种因素影响，如相机📷️噪声以及激光和系统机械稳定性。研究发现全息成像器的本征相位灵敏度远低于活体大鼠模型的相位噪声基底，这证实了我们的神经记录能力不受系统限制（见补充图S4）。活体模型的低频PSD噪声明显更大，这主要归因于生理噪声。
08.数据处理与分析
所有数据处理与分析均在MATLAB 2022b（MathWorks，美国纳蒂克）中完成。
0801.速度波形计算
速度时间序列波形通过公式(1-3)计算获得。对于FES数据，感兴趣区域（ROI）定义为直径0.5毫米的圆形区域。FES数据的全场图通过空间卷积计算，采用步长为一个像素的重叠ROI。视场外的数值不包含在全场图中。对于wS1或癫痫数据，ROI定义为覆盖整个视场的圆形区域。
针对wS1数据，速度波形采用六阶零相位巴特沃斯带通滤波器（截止频率100-500赫兹）进行滤波。对于完整颅骨实验数据，速度信号采用带通滤波（截止频率0.5-450赫兹）。
09.刺激锁定平均
为分析神经活动相关的组织速度特征变化并降低相位噪声，速度信号的刺激锁定平均（SLA）通过以下方法计算：根据刺激起始时间将速度波形分割为多个时段，然后在每个时间点上对所有刺激事件（s）的分段速度（vs）进行平均，即：
其中Ns表示刺激事件次数，ts为时段时间基准，其中[t_pre]和[t_post]分别表示刺激前基线时段和刺激后时段的时间范围。对于wS1数据（图3d），[SLA_v]的包络通过希尔伯特变换的幅值计算获得。
0901.刺激前Z-score标准化
为消除深度成像时光散射效应的影响，对分段速度数据进行了刺激前Z-score标准化处理。标准化公式如下：
其中μpre和σpre分别表示刺激前时段（tpre）内速度信号vs的均值和标准差。在完整颅骨FES实验中，刺激前后时间范围设定为10毫秒；对于wS1数据，该时间范围为25毫秒。
0902.均方根速度计算
为量化光学响应幅值，分别计算了分段速度（vRMS）和刺激锁定平均速度（SLA_vRMS）在刺激后时段（tpost）内的均方根值，图中对应标注为vRMS和SLA_vRMS。
0903.位移计算
组织位移通过对速度信号进行数值积分获得（公式3）。总位移量计算为刺激期间位移变化的极差。癫痫模型中，总位移量根据EEG尖波标记的发作期位移极差计算。
10.统计分析
假设检验前采用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性。暴露皮层FES数据的电流条件比较采用Kruskal-Wallis检验，辅以Dunn-Šidák多重比较校正；药理学数据与基线的比较采用单因素ANOVA结合Dunn-Šidák校正；wS1数据刺激前后比较采用Mann-Whitney U检验；位移数据的刺激范式比较采用Kruskal-Wallis检验结合Dunn-Šidák校正。所有检验显著性水平设定为p<0.05。
11.皮层脑电数据分析
ECoG高频伽马信号处理包括计算各电极高频成分功率（80-350 Hz），该频段与光学数据频段对应且能有效克服生理噪声。采用汉宁窗对13毫秒时间窗（步长0.8毫秒）进行快速傅里叶变换，计算80-350 Hz平均频谱幅值，最后对光学响应对应空间区域的电极信号进行平均。
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