第一步，锁定KEAP1为直接作用靶点
探针设计：合成生物素标记冬凌草乙素（图1a）
靶点捕获：Pull-down实验显示70 kDa特异性条带（图1b-c），质谱鉴定：KEAP1（69 kDa）为高置信结合蛋白（质谱数据图1d）。
第二步，揭示KEAP1-PGAM5调控轴
互作蛋白挖掘：
文献与质谱数据交叉验证发现 PGAM5 为KEAP1关键互作蛋白
Pull-down证实冬凌草乙素可捕获KEAP1-PGAM5复合物（图1e）
生物学意义：
KEAP1通过调控PGAM5影响线粒体凋亡通路，与肝癌进展密切关联
第三步，双维度验证作用机制
结合特异性验证：HuProt™ 蛋白芯片筛选：鉴定662个潜在结合蛋白，KEAP1结合亲和力显著（ΔRFU＞85%），PGAM5无直接结合（图1g-h）
功能依赖性实验
KEAP1敲低：MMP9蛋白表达显著降低
KEAP1敲低+冬凌草乙素：药物效应消失（MMP9无显著变化）→ 证明药理作用完全依赖KEAP1（图1i）
图1
更多详细内容可查看我们的软文分享：【《Adv Sci》解读：HuProt™蛋白芯片筛选抗癌化合物结合蛋白！冬凌草乙素稳定KEAP1-PGAM5抑制肝癌进展】
本文冬凌草乙素小分子筛选蛋白组芯片技术，由广州基云提供支持。
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