利用多能干细胞构建颚骨组织面临挑战，这主要源于目前缺乏选择性诱导颚骨祖细胞的方法，同时也难以重现三维骨细胞网络结构。
本研究提出一种通过人诱导多能干细胞生成颚骨样的类器官的新方法，其关键在于利用下颌突的颚骨祖细胞，即第一咽弓外胚间充质（mdEM）。通过三维培养体系，该研究实现了诱导多能干细胞向神经嵴细胞及mdEM的顺序分化。
该mdEM呈现出由中心向外围的近端-远端模式化分布，精准模拟了颚骨发育过程。当引入外源性咽上皮信号时，mdEM可诱导产生下颌突特异性区域模式化特征。
在成骨条件下培养时，mdEM能够形成颚骨样类器官——该结构包含成骨细胞及网络状骨细胞，嵌入在细胞自身合成的矿化骨基质中。
值得注意的是，将这些类器官移植至存在骨缺损的颚骨区域时，可有效促进骨再生；同时利用成骨不全症（一种以骨质脆弱为特征的遗传疾病）患者来源的诱导多能干细胞构建的类器官，还能重现该疾病的病理表型。本方案为研究人类颚骨胚胎发育与病理生理机制奠定了基础。
由人多能干细胞产生颚骨类器官的机制示意图
文章介绍
题目：由人类多能干细胞产生的颚骨样类器官
杂志：Nat Biomed Eng
影响因子：26.6
发表时间：2025年7月
#1
研究背景
Background
目前尚无研究能够构建出真实可靠的人类颚骨模型，以作为研究颚骨病理生理机制及开发治疗干预手段的基础。
下颌骨的远端和近端部分是通过软骨内成骨方式骨化的，但下颌骨主要通过膜内成骨过程进行骨化。在此过程中，mdEM细胞聚集、直接分化为成骨细胞，分泌富含I型胶原蛋白的细胞外基质，并部分嵌入其中。最终，这些细胞分化为骨细胞，形成矿化骨基质内的3D细胞网络。
然而，由于骨细胞位于矿化基质内部，对其功能的详细研究仍具挑战性。目前，利用多能干细胞在体外部分重现3D骨细胞网络的研究仍较为有限。相比之下，人诱导多能干细胞（iPSC）的三维培养已被证明可在体外促进多种功能性类器官的生成。因此，该研究聚焦于类器官系统，以克服二维培养的局限性，并实现对颚骨组织精确的形态学评估。
该研究建立了一种3D培养体系，用于将人iPSC定向分化为mdEM，并进一步生成颚骨类器官。考虑到未来的临床应用，采用了无异源成分的诱导条件。
此外，利用来自成骨不全症（OI）患者的iPSC重现了该遗传性骨骼脆弱疾病的表型，证明了此类器官的多功能性。
#2
研究关键点
Key points
1）诱导神经嵴细胞（NCC）：利用无异种成分培养体系，通过BMP4预处理和SB/CHIR刺激，诱导iPSC分化为HOX阴性NCC，并在成团培养条件下增强细胞聚集和营养吸收。
2）构建mdEM并诱导分区：将诱导出的NCC在含有FGF8、EDN1和BMP4的培养基中培养，模拟胚胎发育过程中的信号环境，诱导其分化为具有近端-远端模式的mdEM，并形成远端帽区和近端磨牙区。
3）成骨诱导与类器官生成：将mdEM在含有EGF、FGF2、BMP2、CHIR和SAG等因子的培养基中培养，诱导其形成类似颚骨的类器官，通过组织学分析确认其骨组织特征，并在体内实验中验证其骨修复能力和疾病建模效果。
#3
关键研究结果
Results
1、从iPSC中3D诱导产生HOX阴性的NCC
为从iPSC逐步诱导生成颚骨类器官，开发了一种有利于靶向诱导HOX阴性NCC的3D培养系统（图1a）。将分离的人源1231A3 iPSC（一种无异源成分的iPSC细胞系）接种于含ROCK抑制剂Y-27632的96孔V型底超低吸附培养板中（图1b-c），并在振荡培养条件下使用SB431542（SB）/CHIR99021（CHIR）处理4天。
图1 高效诱导iPSC产生HOX阴性NCC。
观察到在这些聚集体中诱导出了CD271high+NCC，也出现了PAX6+神经外胚层细胞。为了减少神经外胚层的形成，在SB/CHIR培养之前对聚集体进行了BMP4处理。使用10 ng/ml BMP4处理1d可有效诱导出SOX10+CD271+TFAP2A+NCC（图1d）。
图1 高效诱导iPSC产生HOX阴性NCC。
流式细胞术分析证实CD271high+NCC得到了富集（94.9±1.9%），而TFAP2A+ECAD+非神经外胚层细胞、PAX6+神经外胚层细胞以及Oct3/4+c未分化iPSC的比例极低（图1f）。
图1 高效诱导iPSC产生HOX阴性NCC。
qPCR分析显示，第5天聚集体中CD271high+分选出的细胞（d5 271H），其NCC标志物的表达水平与先前报道的二维培养方案（2D 271H）相当，并且在这两个细胞群体中多能性标志物POU5F1均呈现下调，反映了NCC的高效诱导。
此外，通过诱导出外周神经元（图1h）、黑素母细胞（图1i）以及间充质干细胞/基质细胞（MSC），证实了聚集体向NCC衍生物分化的潜力。
图1 高效诱导iPSC产生HOX阴性NCC。
接下来评估NCC聚集体中的前后轴身份特征，与RA处理的NCC聚集体相比，未经RA处理的NCC聚集体中HOX基因的表达水平极低。
这些发现证明，该研究建立的3D培养系统能有效从iPSC诱导出HOX阴性的中脑-前部后脑NCC。
2、通过近远端模式诱导mdEM
PA1外胚层间充质沿近端-远端轴的极性特征由Dlx和Hand基因所决定（图2a）。FGF8对于下调NCC标志物SOX10以及上调早期间充质标志物必不可少。FGF8与EDN1的组合诱导了PA1外胚间充质的共同标志物以及mdEM标志物，额外加入BMP4进一步上调了这些基因并激活了远端标志物HAND2。因此，这些通路的同时激活（称为FEDB）被用于后续实验（图2b）。
图2 将NCC聚集体定向分化为mdEM。
FEDB有效地驱动了SOX10⁺NCC分化为TWIST1⁺外胚间充质细胞（图2c-d），且聚集物中央区含有DLX2⁺细胞，中间区含有DLX2⁺DLX5⁺细胞，表层区含有DLX2⁺DLX5⁺HAND2⁺细胞，这表明FEDB生成的mdEM重现了胚胎mdEM的近-远端模式（图2e-g）。
图2 将NCC聚集体定向分化为mdEM。
为进一步阐明EDN1信号通路对mxEM与mdEM分支分化的调控作用，将NCC聚集体同时用FGF8与内皮素受体A型拮抗剂BQ-123进行处理。结果显示，细胞发生了外胚间充质分化，但其分化程度相对低于采用FEDB处理组。抑制EDN1信号显著上调了mxEM标志物（POU3F3和CYP26A1）的表达水平，但对mdEM标志物的表达没有显著影响（图2j,k）。
为探究初始前后轴（A–P）身份信息对mdEM分化的关键作用，研究人员将经RA处理的后部化NCC与FEDB共培养。结果显示，RA处理的NCC虽能分化为外胚间充质细胞，但mdEM标志物表达极低，而HOXB2和HOXB4显著上调，证实NCC的初始位置信息会影响其模式形成通路。
3、利用mdEM重现后期模式形成过程
接下来确定所诱导的mdEM是否具有发育学特征。BMP4信号通路能够引导mdEM向远端帽状区域分化（图3a-b）。将mdEM聚集体置于含有不同浓度BMP4的诱导培养基中进行培养诱导远端帽结构。在BMP4浓度升高时，远端帽结构的主要标志基因HAND1显著上调。
当降低近端信号因子FGF8的浓度时，远端标志基因表达进一步增强，但同时也出现了凋亡细胞的增加。将FGF8替换为FGF2后，细胞存活率提高，因此该研究最终采用了BMP4-high、EDN1-low以及FGF2-low的组合来进行远端帽结构的诱导（图3c）。
图3 mdEM重现了下颌骨的区域性模式。
免疫染色结果显示DLX5表达降低（图3d），并在外层区域清晰检测到HAND1的表达（图3e），这与小鼠远端帽结构的情况相似。
图3 mdEM重现了下颌骨的区域性模式。
在近口腔域诱导过程中，将mdEM聚集体与含有FGF8和Hedgehog信号通路激动剂SAG的多种诱导培养基共同培养，诱导了与近口腔相关的基因表达。此外，当通过BQ-123和LDN193189（LDN）抑制与之相对的区域信号EDN1和BMP4时，这些基因的表达进一步上调。因此，选择FGF8、SAG、BQ-123和LDN的组合用于近口腔域的诱导。
免疫染色显示DLX5的表达得以维持，并且清晰检测到了FOXF1和PITX1的表达。重要的是，这些标志物的表达模式在远端域与近端域的诱导之间存在相互排斥。qPCR和RNA-seq分析进一步验证了这些发现。
4、颚骨样类器官的构建
为模拟膜内成骨过程，该研究将具有致密细胞结构的诱导性mdEM聚集体直接培养于经3D培养优化的无异源成分成骨诱导培养基中（图4a）。第38天获得了直径1.0-1.5 mm的白色聚集体（图4b）。
常用成骨标志物、碱性磷酸酶活性及钙含量均呈现显著提升，且矿化组织的形成（图4c-d）。qPCR分析显示成骨细胞标志物表达量在第26天达到峰值，而骨基质蛋白与骨细胞标志物表达量持续增长至第38天。成熟骨细胞标志物SOS🆘T的表达量在第19天后显著上调（图4e），该结果得到RNA测序分析的验证。
图4 颚骨类器官的生成与表征。
与之相对，部分软骨形成标志物亦有表达，而HOX基因表达量始终维持在较低水平，证实衍生组织保持了位置信息特征。组织学分析显示，聚集体存在具有类骨组织（图4f）。主要的骨基质蛋白——I型胶原蛋白（COLI）在基质中大量表达，非胶原蛋白类骨蛋白如骨钙素（OCN）和骨桥蛋白（OPN）也被检测到（图4g）。
图4 颚骨类器官的生成与表征。
随后，对类骨组织中的细胞特征进行了检测。在第12天出现了SP7+成骨谱系细胞，并在分化过程中逐渐增多。细胞形态逐渐从成纤维样转变为树突状，在诱导26天后，可在表层区域检测到PDPN+PHEX+的早期骨细胞。
至第38天，呈立方体形态的ALP+SP7+成骨细胞排列在组织表层（图4h），并且有相当数量的细胞分化为PDPN+PHEX+的早期骨细胞，其树突状突起从表层延伸至内部区域（图4i-j）。
图4 颚骨类器官的生成与表征。
值得注意的是，在骨基质内部，SOS🆘T+成熟骨细胞形成了3D树突状网络（图4k）。总之，该研究的方法利用mdEM聚集体生成了颚骨类器官，重现了嵌入矿化骨基质中的3D网络状骨细胞。
图4 颚骨类器官的生成与表征。
为评估这些类器官生成更成熟骨组织的潜力，将一个类器官移植至NSG小鼠富含毛细血管的肾被膜下。移植四周后，在肾被膜下观察到白色组织（图4m）。microCT显示该组织高度矿化（图4n）。组织学分析证实了血管和成熟骨组织的形成（图4o）。
图4 颚骨类器官的生成与表征。
此外，这些组织包含人源骨基质以及具有密集树突状突起的人源Vimentin阳性供体细胞（图4p）。这些结果表明，颚骨类器官具有在体内发育为成熟人源骨组织的能力。
图4 颚骨类器官的生成与表征。
5、通过移植颚骨类器官实现骨形成
为评估颚骨类器官的再生潜力，研究人员将三组此类器官直接移植至NSG小鼠直径2.0 mm的下颌骨缺损部位（图5a）。骨移植组作为骨再生能力的对照设置。
移植四周后，与未移植组相比，移植组的矿化组织量显著增加，且与骨移植组相当（图5b）；但类器官移植组的矿化组织密度仍低于骨移植组。
图5 颚骨类器官促进下颌骨形成。
组织学检查发现未移植组虽观察到部分新骨形成，但移植组的骨组织结构与成熟骨移植体高度相似（图5e）。使用人源COLI、OCN和OPN的特异性抗体进行免疫染色，证实了源自颚骨类器官的人源供体细胞分泌了骨基质蛋白，进一步验证了它们对骨再生的贡献（图5f）。
图5 颚骨类器官促进下颌骨形成。
此外，在骨基质中，Vimentin阳性的供体人源骨细胞和Vimentin阴性的宿主小鼠骨细胞均形成了树突状细胞网络（图5g-h），并且在新形成的骨组织周围观察到了抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性的破骨细胞，表明存在活跃的骨重塑过程（图5i）。
图5 颚骨类器官促进下颌骨形成。
移植后对类颌骨进行整体染色显示，新形成的骨与宿主骨发生了过渡性融合，并且具有高度血管化特征（图5j）。这些发现共同表明，移植的类颌骨器官通过成功实现成骨与血管化，促进了骨再生。
图5 颚骨类器官促进下颌骨形成。
6、利用颚骨类器官进行体外疾病建模
从一名COL1A1常染色体显性突变患者体内获取的OI-iPSC中诱导出了mdEM，同时还有基因校正后的OI-iPSC（resOI-iPSC）。经过3天的成骨诱导后，在来自OI-iPSC和resOI-iPSC的聚集体中均观察到了初期COLI的产生（图6a）。
值得注意的是，从OI-iPSC来源聚集体分泌的胶原蛋白对胶原杂合肽（CHP）呈阳性染色，表明产生了错误折叠的三股螺旋链。
到第38天时，与resOI类器官相比，OI类器官中COL1A1、后期骨细胞标志物（DMP1、PHEX、SOS🆘T和MMP13）以及内质网应激标志物（BiP）的表达显著较低，这表明COLI突变影响了类器官中的成骨分化过程。
在OI-iPSC来源的颚骨类器官中，可明显观察到未成熟骨基质（图6b），且骨细胞树突状过程的形成功能紊乱（图6c）。这些异常特征在resOI-iPSC来源的类器官中得到了纠正。
图6 成骨不全症（OI）疾病表型的再现。
随后，OI类器官和resOI类器官被移植到NSG小鼠的肾包膜下。四周后，与resOI类器官相比，OI类器官生成的矿化组织更少且矿化程度更低（图6d）。
组织学分析表明，OI类器官形成了未成熟骨组织，其中含有大量具有OI骨特征典型表现特征的骨细胞（图6e）。这些骨细胞部分处于凋亡状态。相反，resOI类器官显示出这些异常特征的恢复。
图6 成骨不全症（OI）疾病表型的再现。
此外，在OI类器官中，骨细胞的3D网络结构排列紊乱，其树突数量显著少于resOI类器官（图6i）。OI中的骨基质也呈现排列紊乱状态（图6j），提示骨细胞与骨基质之间的相互作用存在异常。这些结果表明，颚骨类器官与OI-iPSC的结合成功再现了成骨不全症的表型。
图6 成骨不全症（OI）疾病表型的再现。
小结
该研究通过调控外源性信号条件，从iPSC经HOX阴性NCC阶段，开发出一种选择性诱导至mdEM的方案。在成骨诱导后，iPSC来源的mdEM形成了具有功能性的类颚骨样结构，其中3D网络状骨细胞嵌入骨基质中。
利用无异源成分条件下培养的iPSC细胞系生成的类下颌骨器官样结构，在研究人类颚骨胚胎发育、病理生理学、治疗药物开发方面具有显著优势，并为更广泛的系统性骨研究奠定了基础，从而推动口腔医学的进一步发展。
参考文献
Motoike S, Inada Y, Toguchida J, Kajiya M, Ikeya M. Jawbone-like organoids generated from human pluripotent stem cells. Nat Biomed Eng. 2025 Jul 2. doi: 10.1038/s41551-025-01419-3.
