STAR Protocols | iPSC 小胶质细胞的气液界面脑皮质类器官步骤 #科技 #胶质 #免疫 #皮质 #细胞 #界面

荷兰乌德勒支大学一研究团队提出了一种用于生成长期含有小胶质细胞的气液界面脑皮质类器官（MG-ALI-CO）培养物的方案，最大限度地减少了坏死核心的形成，提供了一个可用于研究3D类脑环境中的人类神经免疫相互作用的生理相关系统。

文章介绍

题目：生成和使用人iPSC衍生的含小胶质细胞气液界面皮质类器官培养物的方案

期刊：Star Protocols

影响因子：1.4

发表日期：2025年6月

研究背景

Background

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，与许多神经系统疾病有关。啮齿动物和人类小胶质细胞之间的差异凸显了需要额外的模型来充分了解人类病理学。

诱导多能干细胞（iPSC）衍生的小胶质细胞在过去几年中极大地促进了对人类小胶质细胞的研究。目前已经开发了不同的方案，将小胶质细胞纳入神经类器官，提供了更具生理相关性的环境，并允许研究神经免疫相互作用。

最近的进展提供了从神经类器官生成器官型切片的可能性，即气液界面脑类器官（ALI-CO）。这种方法通过促进足够的氧气和营养物质可用性来延长培养期，从而促进神经元成熟增加并最大限度地减少坏死核心的形成。

本研究生成的含有小胶质细胞的气液界面脑皮质类器官（MG-ALI-CO），允许长期的小胶质细胞共培养，能够严格控制小胶质细胞数量或遗传背景，并以高度分枝和均匀分布的小胶质细胞为特征，提供了一种生理相关的人类体外系统。

研究思路

Methods

诱导多能干细胞的培养并分化为脑皮质类器官；
巨噬细胞前体分化；
将巨噬细胞前体整合进ALI-CO；
MG-ALI-CO的2D免疫组化、3D免疫组化和组织透明、共聚焦成像以及电生理记录。

实验设计

Design

ALI-CO和巨噬细胞前体（MacPre）的生成（步骤1-12），再将MacPre整合到ALI-CO（步骤13-23），最后研究神经免疫相互作用（步骤23-39）。

预期结果

Results

MG-ALI-CO系统支持小胶质细胞的长期存活并促进高度分支的形态。这里使用的ALI-CO模型来源于皮质，即使在发育的后期阶段，FOXG1阳性神经元祖细胞也有望存在（图3B）。深层（CTIP2+）和上层（SATB2+）皮质神经元预计广泛分布在DIV140 ALI-CO中（图3C）。

图3 MG-ALI-CO的2D免疫组织化学。

长期培养最终会导致表征神经类器官的玫瑰花状结构的丢失。2D IHC还可用于可视化突触前（SYP）和突触后（PSD-95）标记物，以及它们的共定位（图3D）。

图3 MG-ALI-CO的2D免疫组织化学。

可以对细胞进行3D可视化，从而可以可视化和量化小胶质细胞中存在的突触蛋白。3D IHC提供了评估和量化小胶质细胞吞噬突触蛋白的可能性。小胶质细胞形态和标记物表达可以通过2D IHC进行评估（图3E-F）。

图3 MG-ALI-CO的2D免疫组织化学。

然而，复杂的全细胞形态（如细分支）可以使用3D IHC进行最佳可视化（图4C）。此外，3D IHC准确评估了整个MG-ALI-CO中的小胶质细胞分布（图4D-E）。

图4 MG-ALI-CO的3D免疫组织化学和组织透明化。

通过生物细胞素填充进行神经元稀疏标记，然后进行3D IHC，可以揭示神经元-小胶质细胞的相互作用（图6E）。电生理膜片钳记录能够量化来自MG-ALI-CO神经元的sEPSC频率和幅度（图6C-D），这为研究人员提供了比较不同条件（不同的iPSC系）的指南。

图6 MG-ALI-CO的电生理记录。

MG-ALI-CO模型为研究可以严格控制小胶质细胞数量或遗传背景的人类系统中的神经免疫相互作用提供了新的机会。例如，通过使用具有不同遗传背景（如患病与健康）的MG-ALI-CO以及源自相同iPSC系的小胶质细胞，可以研究细胞自主与非细胞自主效应。

此外，ALI-CO表现出的高水平神经元成熟度和长期共培养的可能性允许研究其他（短寿命）类器官系统中难以观察到的表型，即小胶质细胞对神经元兴奋性或突触修剪的影响。

局限性

MG-ALI-CO系统需要较长的培养期。长期培养通常需要很高的工作量，并且更容易受到感染。

此外，尽管YS-EB由所有iPSC品系形成，但并非所有iPSC品系都能产生MacPre。这可以通过使用明场显微镜🔬检查培养板来确定，并且在收集后的细胞计数期间也反映在MacPre的低绝对数量上。

最后，在突触IHC的后处理过程中，可能需要调整每张图像的PSD-95信号以获得最佳结果。然而，对于PSD-95相关的条件之间的定量比较，这种调整需要保持一致。因此，必须仔细执行这些分析以确保结果准确，这可能需要图像分析专业知识。

操作步骤

（一）诱导多能干细胞培养：时间不定

在StemFlex中，在明胶包被的培养皿上培养iPSC，每周更换三次完全培养基。iPSC达到80%至90%的密度后，用0.5 mM EDTA分离并在补充有5 μM Y-27632二盐酸盐的StemFlex中培养24小时，然后更换为StemFlex。

关键：在开始任何分化方案之前，iPSCs应该是70-90%的密度，并且干细胞集落应该没有错误分化的迹象（例如，非紧密菌落）。

（二）脑皮质类器官生成：50天

1. 在类器官培养的体外第0天（DIV0），将9000个iPSC接种在在超低附着（ULA）96孔板上的补充50 μM Y-27632二盐酸盐和4 ng/mL FGF2的150 μL hES0培养基中。

2. 在ULA 96孔板中培养类器官，直至达到约DIV50。

a.在DIV2和DIV4，将所有培养基更换为补充有2.5 μM Dorsomorphin和10 μM SB-431542的150 μL hES0培养基。
b.在DIV6，全部更换为补充有20 ng/mL EGF和20 ng/mL FGF2的神经培养基。
c.每周更换三次完整的培养基。
d.在DIV25，用补充有20 ng/mL BDNF和20 ng/mL NT-3的神经培养基替换所有培养基。
e.每周更换所有培养基三次。
f.DIV43后，每周用无补充的神经培养基完全更换培养基三次，直至ALI-CO切片。

（三）巨噬细胞前体分化：3-8周

注意：应与“皮质类器官生成”和“气液界面皮质类器官生成”中的步骤平行进行。

3. 在DIV0时，在96孔板中生成卵黄囊胚状体（YS-EB）。在每个孔中，将9000个iPSC接种在补充有50 μM Y-27632、50 ng/mL BMP-4、20 ng/mL SCF和50 ng/mL VEGF的150 μL SF-EB培养基中。

4. 在DIV2，更换包含所有上述因子的所有介质。

5. 在DIV4，收集YS-EB并在1xPBS中洗涤，然后将10至15个YS-EB转移至MacPre培养基中的6孔板的孔中，该培养基补充有100 ng/mL M-CSF和25 ng/mL IL-3。

6. 每5至7天更换2/3的MacPre培养基。注意不要吸入YS-EB。

7. 在YS-EB转移后2~3周，MacPre开始在培养基中出现。

注：YS-EB将形成囊状卵黄囊样结构，并经常粘附在孔的底部。

（四）气液界面皮质类器官生成：90天

注意：在结束向类器官培养基中添加因子后不久进行类器官切片，以防止坏死核心形成。

8. 准备切片设置。

a.用70%乙醇大量喷洒振动切片机，置于流罩中，在紫外线中灭菌30分钟。

关键：确保与有机物接触的振动切片机（如刀片、安装板和托盘）暴露于紫外线下，并喷洒70%乙醇。

b.在1xHBSS中制备3%低熔点琼脂糖溶液。

注意：琼脂糖可预先制备。在切片过程中，将琼脂糖置于50℃的振荡器（60 rpm）上，使其保持液态，以进行包埋。

c.将两侧0.45 μm的膜暴露于紫外线下30分钟灭菌，用无菌剪刀切成约5x5 mm的片。
d.将1xHBSS置于冰柜中，获得糊状但未完全冷冻的溶液。

9. 在3%低熔点琼脂糖中包埋最多15个类器官。

a.使用带宽口径枪头的P1000移液器收集DIV50的类器官，并在18-20 ℃下用1xHBSS在6 cm皮氏培养皿中快速清洗。

关键：收集发育良好的圆形类器官用于切片。太小（直径<1 mm）或芽太多（即未分化的典型征象）将无法在切片程序中存活。

b.根据包埋的类器官数量，将类器官转移至35 mm或6 cm培养皿中，用熔化的琼脂糖填充，并用P20吸头移动类器官。

注意：当包埋超过6个（最多15个）类器官时，使用6 cm皮氏培养皿。

关键：为了避免切片过程中类器官从琼脂糖上松动，用P20吸头在类器官周围移动，将与类器官一起转移的HBSS与周围的琼脂糖混合。

c.通过使类器官沉到培养皿底部，确保类器官放置在琼脂糖内的同一水平面上。

关键：确保琼脂糖溶液在用于包埋时不含气泡。制备后可能会出现气泡，但随后会迅速消失。

d.将包埋的器官置于冰块上约20分钟，使琼脂糖聚合。

10. 将含有包埋类器官的琼脂糖块置于振动切片机上。

a.用刀片去除类器官周围多余的琼脂糖，并将包埋的类器官从培养皿中取出。

b.将琼脂糖块倒置，使类器官位于琼脂糖块的上部，可避免对不含类器官的琼脂糖进行不必要的切片。
c.将包埋有类器官的倒置琼脂糖块粘附到振动切片机的支架上。

11. 用振动切片机将类器官切片。

a.用冰冷的1xHBSS填充振动刀腔。在不同iPSC系的类器官之间改变1xHBSS。
b.将类器官切成250 μm厚的切片（速度0.12 mm/s，频率45 Hz）。
c.用带宽口径枪头的P1000移液器收集切片，并将切片转移至含有预热的回收培养基（含新添加的青霉素-链霉素两性霉素PSA，终浓度1X）的6孔板中。
d.将6孔板中的切片与回收培养基在37℃孵育至少1小时。

12. 将ALI-CO转移至培养插入物中继续培养直至收获（图1）。

a.用1.5 mL ALI-CO培养基（含新鲜添加的PSA）和1个悬浮细胞培养插入物/孔制备6孔板。
b.将4-6个切割膜置于悬浮细胞培养插入物中。

注意：使用0.45 μm膜以使ALI-CO的收获更容易。通过使用单独的膜而不是直接在插入物上培养ALI-CO，更容易收集单个ALI-CO。可使用无菌镊子小心地提起膜并收集特定的ALI-CO。

c.使用带宽口径枪头的P1000移液器将ALI-CO转移至预热的6孔板中的膜上。在每个滤膜中间上放置一个ALI-CO。
d.第二天，用含新鲜添加的PSA的培养基完全更新ALI-CO培养基。
e.随后，每周更换培养基三次，直至收获。

图1 膜和细胞培养插入物上的ALI-CO。

（五）巨噬细胞前体整合到ALI-CO中：2小时

注意：MacPre通常在YS-EB接种后2至3周之内在培养基中出现（取决于iPSC系和批次）。如果每周更换培养基，则YS-EB产生MacPre细胞直至第8周。然而，高度建议将收集限制到第5周，因为随着培养时间的增加，MacPre细胞明显改变形态（即肿胀）。

关键：开始收集前，应在显微镜🔬下检查培养物，以确认培养基中是否存在MacPre（图2B）。

13. 将用于整合的ALI-CO置于补充有10 ng/mL M-CSF和100 ng/mL IL-34的ALI-CO培养基中的单独悬浮细胞培养插入物上。

关键：仅使用直径≥4 mm的ALI-CO进行MacPre集成，因为较小的ALI-CO无法在集成中存活。小型ALI-CO将在整合后2-3周开始死亡。

14. 将37 μm细胞过滤器放入50 mL Falcon管中，并通过过滤器添加1 mL MacPre培养基。

15. 使用P1000移液器将各孔中80%的MacPre培养基通过细胞过滤器转移。

注意：转移培养基时避免取大块组织或YS-EB。如果无法避免这种情况，可以在收集完成后使用可逆过滤器将YS-EB转移回孔中。

注意：在含有大量MacPre的孔中，可观察到细胞“云”。尽可能多地收集这些云。

16. 用1 mL MacPre培养基冲洗过滤器，并从过滤器下方收集任何剩余液体。

17. 在18至20℃下以200 rcf离心细胞5分钟。

18. 将沉淀重悬于补充有10 ng/mL M-CSF和100 ng/ mL IL-34的200 μL ALI-CO培养基中，并使用台盼蓝进行活细胞计数。

注意：如果沉淀非常大，并且由于细胞密度高而难以计数，则用额外的培养基稀释细胞。

注意：一个6孔板通常产生1-1000万MacPre，取决于iPSC系。

关键：MacPre活力应高于75%，以确保最佳分化，并避免由于大量死细胞而损害ALI-CO质量。

19. 根据计算的细胞密度，将浓度调节至10^4个细胞/μL。

20. 将10 μL液滴（10^5个细胞）置于ALI-CO顶部，等待约2分钟，然后将培养板放回孵育器。

注意：根据MacPre的可用性，每个ALI-CO可以集成10^5到2×10^5 MacPre。

注意：根据ALI-CO尺寸，液滴体积可以为10±5 μL。含MacPre液滴应覆盖整个ALI-CO，但不溢出。如果细胞密度太低，达不到10^4个/μL，可以连续滴加两到三滴，直到在ALI-CO上接种的细胞总数达到10^5-2×10^5。为此，建议每次滴加之间间隔3到5分钟，或直到滴液明显凹陷到ALI-CO中。

21. 48 h后，每隔一天完全更换ALI-CO培养基，补充新鲜的10 ng/mL M-CSF和100 ng/mL IL-34，持续一周。

22. 继续每隔一天更换所有培养基，并在培养基更换期间每隔一周补充新鲜的M-CSF和IL-34。

注意：MG-ALI-CO培养基更换可与ALI-CO相同，因为整合程序后MacPre可快速附着于组织。

注意：此处，仅在MacPre整合后两个月内评估MG-ALI-CO（DIV140-150）。旨在培养MG-ALI-CO更长时间的研究人员应该评估小胶质细胞密度，形态和标志物表达是否得到维持。

图2 MacPre集成到ALI-CO中。

（六）MG-ALI-CO的2D免疫组化：4天

注意：MG-ALI-CO的冷冻切片后进行2D IHC，提供了在一个MG-ALI-CO内对多种细胞类型或细胞结构进行快速和有效染色的可能性（图3A）。

23. 将MG-ALI-CO固定并脱水。

a.固定类器官。

i. 用无菌镊子小心地提起膜的一侧，收集MG-ALI-CO，并将MG-ALI-CO放入贴有标签并装有1 mL 1xPBS的2 mL Eppendorf管中（每个Eppendorf管一个MGALI-CO）。

注意：在固定过程中，保持MG-ALI-CO与膜连接，以防止显著的形状变化。

ii. 用1 mL含4% PFA的PBS溶液替换1xPBS。
iii. 将MG-ALI-CO在PFA中于4℃下在振荡器上孵育12-16小时。
iv. 第二天，取出PFA，用1xPBS清洗3次，每次5分钟。

暂停点：固定的MG-ALI-CO可在4℃下长期储存于含1xPBS的2 mL Eppendorf管中。当样品储存超过1个月时，向PBS中加入NaN3（0.05%），以防止细菌和真菌感染。

b.将MG-ALI-CO转移至装有1xPBS的6 cm培养皿中。
c.使用P1000移液器将PBS水平分配至组织两侧，小心地从膜上去除MG-ALI-CO。

关键：从膜中取出MG-ALI-CO时，请勿破坏组织。MG-ALI-CO应可轻松分离。如果没有，尝试将P1000吸头尽可能靠近MG-ALI-CO，同时用吸头向下按压膜，防止膜移动。MG-ALI-CO的易分离程度取决于所用的iPSC系。

d.使用带宽口径（或切割）枪头的P1000移液器将MG-ALI-CO转移至15 mL Falcon中，并加入5 mL 30%蔗糖的1xPBS溶液，在4℃下孵育12-16小时，或直至MG-ALI-CO沉至管底。

24. 包埋类器官。

a.准备一个装有异戊烷的玻璃烧杯，并将其嵌入装有干冰的桶中。
b.确保异戊烷的温度在-30℃和-50℃之间。
c.使用带宽孔（或切割）吸头的P1000移液器收集MG-ALI-CO，并将其置于包埋模具中。
d.在不接触MG-ALI-CO的情况下，使用P200移液器从模具中去除过量的蔗糖。
e.用Tissue-Tek OCT填充模具，防止OCT内形成气泡。
f.使用P10吸头将MG-ALI-CO轻轻移至模具中间。

注意：当向同一模具中添加多个MG-ALI-CO时，确保MG-ALI-CO在同一水平面上彼此相邻位置。

g.小心地将包埋模具放入冷异戊烷中，直到OCT完全冷冻（1-2分钟）。
h.将包埋的MG-ALI-CO置于干冰上，然后在-80℃下储存。

25. 对包埋的类器官进行冷冻切片。

a.将低温恒温箱温度设置为-19℃，并设置目标温度为-17℃。
b.使用一滴OCT将带有OCT的MG-ALI-CO安装在支架上。
c.让包埋块适应灭菌室温度约30分钟。
d.将MG-ALI-CO切成20 μm厚的切片。将切片安装在SuperFrost Plus粘附玻片上。
e.将载玻片上的切片风干至少1小时，然后储存在-80℃。

注意：如果载玻片上的切片干燥缓慢，在储存前吹干切片。

暂停点：在进行IHC程序前，载玻片可在-80℃下长期储存。

26. 对MG-ALI-CO切片进行IHC。

a.用封闭液封闭组织。
i. 从-80℃下收集载玻片，并在18-20℃下解冻至少15分钟（最多2小时）。
ii. 将载玻片置于装有1xPBS的容器中，在振荡器上振荡10分钟。
iii. 在孵育盒中用封闭液孵育载玻片约1小时。
b.用一抗溶液孵育载玻片。
i. 准备一个潮湿的、有盖的孵育盒，其中载玻片可以放在一个平面上。

注意：如果一抗与荧光团结合，则从该步骤开始，尽可能将载玻片置于黑暗中。

ii. 弃去封闭液，用300 μL/玻片的封闭液稀释的一抗覆盖玻片。
iii. 在4℃下孵育12-16小时。
c.在孵育盒中用二抗溶液孵育载玻片。
i. 用1xPBS清洗载玻片三次，一次短暂清洗，两次5分钟。

注意：如果二抗与荧光团结合，则从该步骤开始，尽可能将载玻片置于黑暗中。

ii. 在18-20℃下，将玻片与300 μL/玻片的封闭液稀释的二抗孵育1小时。
iii. 用1xPBS冲洗载玻片。
iv. 在18-20℃下，用300 μL DAPI（1 μg/mL，溶于1xPBS）/玻片孵育15分钟。
v. 用1xPBS清洗载玻片两次，每次5分钟。
d.去除载玻片上的PBS，并使用FluorSave试剂和盖玻片进行封片。

图3 MG-ALI-CO的2D免疫组织化学。

（七）MG-ALI-CO的3D免疫组化和组织清除：5天

注意：3D IHC提供了获得MG-ALI-CO中细胞-细胞相互作用和连接的完整图像的可能性（图4A）。

图4 MG-ALI-CO的3D免疫组织化学和组织透明化。

27. 按照2D免疫组织化学方案的步骤1和2所述进行固定。

注意：建议在开始封闭步骤前制备WB1、WB2和FUnGI，因为这些缓冲液的制备时间需要一整天。

28. 用WB1封闭组织。

a.从膜上除去MG-ALI-CO后，将其转移至Eppendorf管中，并除去所有PBS。
b.向试管🧪中加入500 μL WB1，轻轻倒置，确保MG-ALI-CO浸没在WB1中。
c.取一个50 mL试管🧪，在底部放入小块薄纸。
d.轻轻翻转Eppendorf管，将其倒置在50 mL管中的薄纸上。
e.在Eppendorf周围和顶部添加纸片，确保其不会移动。

注意：如果正在处理多个MG-ALI-CO，则将另一个Eppendorf试管🧪加入50 mL试管🧪中，并重复操作，直至试管🧪装满。用薄纸片稳定Eppendorf管，并密封50 mL管。

f.将50 mL试管🧪置于18-20℃的振荡器或滚筒组上4小时。

暂停点：封闭后，MG-ALI-CO可在WB2中于4℃下储存2天。但是，应尽快继续研究方案。

注意：从50 mL试管🧪中取出Eppendorf试管🧪时，首先取出大部分薄纸碎片。这样可以防止Eppendorf试管🧪的盖子意外打开。

29. 对MG-ALI-CO进行IHC。

a.在WB2中制备一抗混合物。每个MG-ALI-CO，需要500 μL抗体混合物。

关键：制备一抗混合物时，仅加入所需量抗体的一半。第二天有一个补充步骤，在此期间添加了后半部分。例如，对于具有1:1000的工作稀释度并且需要。例如，在一个实施例中，5 μL未稀释抗体，第一天加入2.5 μL（1:2000稀释），第二天加入2.5 μL（1:1000最终稀释）。

注意：当使用偶联抗体时，将其添加到二抗混合物中。

i. 在不破坏MG-ALI-CO的情况下，从Eppendorf管中去除WB1，并替换为一抗混合物。
ii. 倒置Eppendorf试管🧪，放回50 mL试管🧪中。
iii. 将50 mL试管🧪置于振荡器或滚筒组上，并在18至20℃下孵育12-16小时。
b.第二天，将一抗总量的另一半直接加入到装有MG-ALI-CO的Eppendorf管中，以达到最终的抗体浓度。
c.将50 mL试管🧪放回振荡器或滚筒组中，并在18至20℃下孵育12-16小时。

d.清洗MG-ALI-CO并制备二抗混合物。
i. 从50 mL试管🧪中取出Eppendorf管，轻轻去除一抗混合液。
ii. 洗涤时，加入500 μL WB2，并将Eppendorf管放回50 mL管中。
iii. 将50 mL试管🧪放回振荡器或滚筒组中，在18-20 ℃下放置1小时。
iv. 重复此步骤2次（总共洗涤3次，每次至少1小时）。

注意：确保在清洗步骤之间去除所有液体，以防止非特异性一抗结合，并避免在清洗过程中损伤组织。

暂停点：清洗后，MG-ALI-CO可在WB2中于4℃下储存2天。但是，应尽快继续研究方案。

v. 在WB2中制备二抗混合物。每个MG-ALI-CO，需要500 μL抗体混合物，包括1 μg/mL DAPI。

关键：当制备二抗混合物时，仅加入所需抗体量的一半。与一抗类似，第二天有一个补充步骤，在此期间加入剩余抗体。

vi. 在不破坏MG-ALI-CO的情况下，从Eppendorf管中去除WB2，并替换为二抗混合物。

注意：从该步骤开始，尽可能将MG-ALI-CO置于暗处。

vii. 倒置Eppendorf管并放回50 mL管中。
viii. 用铝箔包裹50 mL试管🧪，使MG-ALI-CO避光保存。
ix. 将50 mL试管🧪置于振荡器或滚筒组上，并在18-20℃下孵育12-16小时。
e.向装有MG-ALI-CO的Eppendorf管中加入二抗总量的另一半（包括DAPI），以达到最终抗体浓度。
f.将用铝箔包裹的50 mL试管🧪放回振荡器或滚筒组中。
g.在18-20℃下孵育12至16小时。

30. 清除组织。

a.清洗MG-ALI-CO。
i. 轻轻取出二抗混合物。
ii. 洗涤时，加入500 μL WB2，并将Eppendorf管放回50 mL管中。
iii. 将50 mL试管🧪置于振荡器或滚筒组上，在18-20℃下放置1小时。
iv. 重复此步骤2次（总共3次洗涤，每次至少1小时）。
b.执行FUnGI程序。
i. 在WB2中制备33%和66%FUnGI混合物（使用100%FUnGI贮备液）。
ii. 通过短暂涡旋使混合物均匀。
iii. 将所需量的33%和66%混合物以及100% FUnGI溶液保持在18-20℃下。

注意：混合前将100% FUnGI溶液加热至18-20℃，以降低粘度。缓慢滴加FUnGI溶液，避免产生气泡。如有必要，使用切割的P1000吸头。

iv. 在不破坏MG-ALI-CO的情况下，从Eppendorf管中取出WB2，并更换为500 μL 33%FUnGI混合液。
v. 将Eppendorf管放回50 mL试管🧪中。
vi. 将铝箔包裹的50 mL试管🧪置于振荡器或滚筒组上，并在18-20℃下孵育1小时。

注意：始终在清洗当天新鲜制备33%和66%FUnGI混合物，因为WB2中的BSA不能在18-20℃下保存>24小时。

注意：在整个清洗过程中，MG-ALI-CO将逐渐变为半透明。从该步骤开始清除液体时应格外小心，以免意外损坏MG-ALI-CO的半透明部分。

vii. 小心除去33%FUnGI混合液，并更换为500 μL 66%FUnGI混合液。
viii. 将Eppendorf试管🧪放回50 mL试管🧪中。
ix. 将铝包的50 mL试管🧪置于振荡器或滚筒组上，在18-20℃下放置1小时。
x. 小心取出66%FUnGI混合液，并更换为500 μL 100%FUnGI。
xi. 将Eppendorf试管🧪放回50 mL试管🧪中。
xii. 将铝包的50 mL试管🧪置于振荡器或滚筒组中，在18-20℃下放置3小时。

暂停点：染色和澄清的MG-ALI-CO可在4℃下避光储存约1至2周，然后进行组织封片。

注意：FUnGI清除过程可以反向进行。

31. 在两块盖玻片之间安装已清除的MG-ALI-CO。

注意：使用两块薄（0.16 mm）盖玻片安装MG-ALI-CO（图5）。

图5 安装在FUnGI溶液中的MG-ALI-CO。

a.将一个薄盖玻片放置在平整干净的表面上。
b.取一个双面粘性iSpacer，取下一侧的贴纸盖，并将iSpacer放在盖玻片的中央。
c.轻轻按压iSpacer的边缘，确保其完全附着在盖玻片上。
d.用镊子轻轻取下iSpacer顶部的贴纸盖。
e.将约200 μL 100%FUnGI（RT）滴在iSpacer内盖玻片的一侧。

注意：100%FUnGI的液滴应足够大，以完全覆盖已清除的MGALI-CO，而不会充满iSpacer，因为这可能导致泄漏。

f.使用带有切割尖端的P1000移液器，小心地将清除的MG-ALI-CO置于iSpacer内的100%FUnGI液滴中。

注意：MG-ALI-CO将完全或几乎完全半透明，具体取决于其尺寸。因此，在Eppendorf管中很难定位，在提升和定位过程中应小心不要损坏MG-ALI-CO。

g.从MG-ALI-CO所在的一侧开始，轻轻按压iSpacer上的第二个盖玻片。缓慢降低iSpacer上的玻璃，从MG-ALI-CO一侧到另一侧。这可让FUnGI均匀地散布在iSpacer上。
h.确保MG-ALI-CO完全被FUnGI覆盖并浸没在FUnGI中。
i.在iSpacer边缘的正上方小心地向下按压顶部盖玻片，以紧紧地固定盖玻片。
j.封片后的MG-ALI-CO可立即成像或在4℃下长期避光储存。

注意：将安装好的MG-ALI-CO水平存放在暗处，以防止iSpacer中的FUnGI泄漏。MG-ALI-CO需要保持浸没在FUnGI中。

注意：确保安装好的MG-ALI-CO与两侧的盖玻片接触，以将其牢固地固定到位。否则，组织可能“漂浮”在FUnGI中，导致成像期间组织漂移。

关键：FUnGI粘度受温度变化的影响。当封固的MG-ALI-CO在4℃下储存时，在成像前将其在18-20℃下（黑暗中）保存约30分钟。

（八）共聚焦成像：时间不固定

注意：为了鉴别细胞类型或大体细胞形态，使用落射荧光显微镜🔬对2D染色MG-ALI-CO进行成像就足够了。然而，细胞间相互作用或全细胞形态的可视化通常需要3D IHC。建议使用共聚焦显微镜🔬对3D染色和清除的MG-ALI-CO进行成像，以减少背景荧光。

注意：在研究突触时，建议使用DIV140或更早的MG-ALI-CO，因为从这个时间点开始，突触前和突触后标记物大量存在。

32. 对突触前和突触后隔室进行成像。

注意：这些图像可用于量化，例如，突触数量和大小，或评估突触前和突触后标记的共定位。

a.使用共聚焦显微镜🔬成像MG-ALI-CO。
i. 使用MAP2、SYP和PSD-95抗体分别鉴定树突以及突触前和突触后隔室。使用DAPI标记细胞核。
ii. 使用63x物镜并获得至少一个细胞厚度的z-stack，z-切片之间的间隔约为0.3 μm。使用DAPI染色在z-stack中导航。

注意：不要捕获太多z-切片或太厚的z-stack，这会增加背景荧光。

注意：z-切片之间的最佳间隔大小取决于多个因素（共焦显微镜🔬轴向分辨率）。

关键：需要高激光功率（约70-100%）来捕获结合单结构域PSD-95抗体的信号。

b.使用FIJI软件进行图像后处理。
i. 用突触标记调整通道的亮度和对比度，以便在低背景信号下可以看到突触点。

33. 小胶质细胞成像。

注意：使用3D IHC进行小胶质细胞形态学和分布分析。

a.用共聚焦显微镜🔬对MG-ALI-CO成像。分别使用MAP2和IBA1抗体以及DAPI使树突、小胶质细胞和细胞核可视化。

注意：MAP2不是必需的，但有助于评估组织质量。神经元标记物(TUBB3）可以代替MAP2。

注意：PU.1和CD68抗体可用于鉴别巨噬细胞和小胶质细胞。该分析需要标记整个小胶质细胞的标记物，例如IBA1。

b.为了评估小胶质细胞形态，使用63x物镜对单个细胞进行成像，生成足够厚的z-stack以包含目标细胞。
i. 0.75 μm的z轴切片间隔足以捕获详细的形态。
ii. 使用IBA1通道在z轴切片中导航，并确保存在可分配给该单元格的细胞核（DAPI）。
c.为了评估小胶质细胞的分布和密度，使用10x倍物镜对整个MG-ALI-CO进行成像。

i. 获取多个图块和一个可捕获整个MG-ALI-CO的z-stack。这可能需要几个小时。
ii. z轴切片之间6.8 μm的距离足以显示小胶质细胞的分布和密度，以及捕获大体细胞形态。
iii. IBA1通道的成像足以评估这些参数。
d.在FIJI软件中进行形态学后处理和分析。

i. 通过生成每张图像的最大投影来分析小胶质细胞形态。或者，可以使用像Imaris这样的软件来以3D方式可视化整个细胞。
e.在FIJI软件中进行后处理和分析小胶质细胞分布。
i. 将z-stack的MG-ALI-CO图像分为三个部分：顶部、中部和底部。
ii. 在每个切片内，选择总数约为15-20 μm的多个相邻z切片，以进行最大投影。选择每个相应截面的代表性z切片。
iii. 在每个切片的代表性最大投影范围内，选取3个500x500 μm的ROI，计数每个ROI的小胶质细胞数，得到细胞密度（每mm2的细胞数）。可以手动或使用"analyze particles"插件进行计数。

（九）MG-ALI-CO的电生理记录：2天

注意：在神经元上进行电生理记录可以详细了解其功能特性（图6）。

图6 MG-ALI-CO的电生理记录。

34. 准备电生理学实验装置。

a.记录当天制备人工脑脊液（aCSF）和内液。

关键：为防止核苷酸降解，在整个记录日将内溶液置于冰上。

注意：使用单批内部溶液有助于最大限度地降低单次实验不同记录日之间的差异。

b.向内部溶液中加入0.5%生物细胞素，以便在记录后能够可视化和形态重建细胞。

关键：在用95%O2和5%CO2氧化aCSF至少10分钟后，分别从1M储备液中加入MgCl2和CaCl2。这用于防止因pH值变化而导致不溶性碳酸盐沉淀。

注意：开始记录前，将新鲜制备的aCSF保存在37±1℃下。

c.配置放大器的设置，在2.9 kHz下使用4-pole贝塞尔滤波器进行低通滤波。使用PatchMaster v.2x92软件，通过EPC 10双路径钳位USB放大器以20 kHz对记录进行数字化。

注意：任何选定的放大器均可配置类似的设置。

d.收集MG-ALI-CO并准备进行修补。
i. 在37±1℃下用新鲜aCSF制备3.5 cm细胞培养皿，用95%O2和5%CO2充氧。
ii. 用无菌镊子小心地提起膜的一角，收集MG-ALI-CO，并将仍附着在膜上的MG-ALI-CO置于含aCSF的培养皿中。

注意：避免镊子接触aCSF。

iii. MG-ALI-CO现在可以转移到电生理学装置中，无需采取措施确保无菌性。MG-ALI-CO将在修补后直接修复。
iv. 将MG-ALI-CO（仍附着在膜上）放入电生理装置的记录室中。
v. 在37±1℃下，使用蠕动泵以2.5 mL/min的流速连续氧化aCSF。

注意：电生理学装置还应包括一个带倾斜照明的正置显微镜🔬和一个40倍水浸物镜，以观察细胞。

35. 开始膜片钳记录。

a.识别位于MG-ALICO边缘±500 μm范围内的候选细胞进行修补。

注意：兴奋性皮质投射神经元在皮质类器官中发育，从3个月开始，主要位于边缘500 μm内。仅考虑位于距离MG-ALI-CO边缘±500 μm处的神经元进行修补。

i. 使用电阻为3至5 MΩ的硼硅酸盐玻璃电极进行修补。
ii. 补片前补偿移液器阻力。
iii. 在-65 mV的静息膜电位下，以电压钳配置贴附细胞。或者在该步骤中补偿液结电位。
iv. 细胞破入后，立即切换至电流钳（I=0 pA）配置，以评估静息膜电位（Vm）。

关键：如果电池Vm>-40 mV，则停止。

v. 切换回-65 mV的电压钳位，让电池静置2分钟，以确保记录期间的稳定性。

关键：如果漏电流（I泄漏）<-150 pA或串联电阻（Rs）>25 MΩ，则停止。

b.测量sEPSC以评估突触连接性。
i. 在-65 mV静息膜电位下运行间歇性电压钳方案5分钟。
ii. 每10秒开始一次新的扫描，总计达到30x10秒。
iii. 在每次扫描中，在t=1 s时执行500 ms-5 mV的步骤，以便离线分析被动膜特性，例如：Rs、输入电阻（Ri）和电池电容（Cm）。
c.重复上一步以收集每个单元格的更多数据。

注意：建议每个MG-ALI-CO仅记录一个细胞，因为这允许将膜片钳记录与生物素填充细胞的分析配对。这使得细胞形态学和电生理学特性能够相互关联。

d.在2 mL Eppendorf管上贴上标签，用镊子轻轻提起滤膜，转移MG-ALI-CO。
e.按照“2D免疫组织化学”的步骤23中所述，固定MG-ALI-CO。

36. 选择细胞以分析获得的电生理记录。

a.包括符合以下标准的电池：Rs<25 MΩ，I泄漏>-150 pA，Vm<-40 mV。

关键：必须遵守临界参数，以确保记录数据的质量。

37. 将获得的电生理记录.dat文件转换为.abf格式，在Clampfit中打开.abf文件。

注意：在GitHub资源库中的Python脚本可以将.dat文件转换为.abf格式。或者，也可以使用所选的分析软件直接打开和分析.dat文件。

38. 在Clampfit中评估电池的被动膜特性。

a.计算Rs，作为试验脉冲幅度与记录的电容电流幅度的比值。
b.通过将试验脉冲幅度除以试验脉冲结束时测得的稳态电流幅度来确定Ri。
c.通过将总电荷（Q）除以测试脉冲幅度计算Cm，其中Q通过计算从测试脉冲开始到达到稳态电流点的电容电流曲线下的面积。
d.如果在记录过程中平均Rs>25 MΩ或Rs变化>30%，则从分析中排除记录。
e.当细胞的静息膜电位>-40 mV时，也应排除细胞。

39. 测定所含细胞的sEPSC频率和振幅。

注意：使用“事件检测”下的“模板搜索”功能，半自动检测单个sEPSC事件。

a.将单个代表性sEPSC模板用于“事件极性”选择为负向的所有记录。
b.将基线设置为“模板中”，并将“模板匹配阈值”设置为3.5。
c.手动确认或拒绝每个识别的事件。
d.通过将确认事件的数量除以分析的总记录时间（s）来确定频率（Hz）。
e.取所有确认事件的平均值，确定振幅（pA）。
f.识别并排除离群值，例如，使用Prism 9中内置的“识别离群值”分析（ROUT，Q=1%）。

材料

设备

参考文献

Cañizares Luna M, Mars M, Jakobs CE, Huffels CFM, Ermakov A, Hol EM, Pasterkamp RJ. Protocol for generating and using human iPSC-derived microglia-containing air-liquid-interface cortical organoid cultures. STAR Protoc. 2025 Jun 30;6(3):103915. doi: 10.1016/j.xpro.2025.103915.