一、引言
（一）历史沿革
在组织学领域，快速处理组织对于实现快速诊断、提升便利性和效率而言，具有举足轻重的优势。最早缩短处理时间的方法是对标本进行加热处理。而将微波处理器引入实验室，为组织和细胞的加热提供了一种更具可控性的方式。微波能够穿透生物材料，克服了热传导性能差的局限，从而使被处理标本的受热更加均匀。
1970年，微波固定技术被应用于组织学处理，在小鼠和新鲜人体尸检组织中取得了令人满意的结果，且产生的伪影极少。1978年，Login提出了在恒定体积的液体浴中加热组织以稳定微波腔内温度的理念，并通过研究比较了组织在不同溶液中的加热效果，发现将组织置于盐水或Zenker溶液（组织学家使用的一种含氯化汞和乙酸的固定剂）中加热，效果要优于在福尔马林中小加热。
研究表明，微波固定的组织能保留酶活性和免疫反应性；微波辅助加热切片是一种高效的抗原修复方法；利用微波还能缩短免疫标记时间；微波照射可加快人颞骨脱钙速度，且对超微结构或抗原性无明显不良影响。由此，微波处理器成为组织学实验室中加热生物标本和加快处理速度的常规工具。
微波技术最初引入电子显微镜🔬实验室时，仅局限于标本加热相关方法。尽管微波诱导加热能得到可用于保存的标本，但产生的超微结构损伤无法满足关键研究需求。后来，在醛类存在的情况下进行微波诱导加热，逐渐成为一种可行的电子显微镜🔬快速固定方法。通过在处理器腔内使用水负载，或用含循环水的冷却套包裹组织，实现了更精确的温度控制下的微波处理。与在室温下进行的常规处理方法相比，对微波辅助处理生物材料的仔细评估开始显示出其在改善形态方面的优势。对微波处理的骨骼进行检查发现，其超微结构和抗原保留均得到改善。一项能让生物材料在不受热的情况下暴露于微波的技术发展，引发了一场至今尚未完全解决的争议，即是否存在独立于温度的“纯微波效应”。早期研究认为，微波照射导致的标本加热是缩短制备时间和改善超微结构的原因。然而，近期在更严格控制条件下的研究似乎表明，在没有热量的情况下，微波在缩短处理时间和改善超微结构方面也发挥着作用。微波对细胞膜的电磁效应支持了纯微波效应的存在，这在大肠杆菌中已得到证实。
（二）微波处理器在生物医学研究中的当代应用
微波处理器已成为组织学实验室必不可少的工具，并已融入常规实验方案中。微波被用于辅助标本固定、石蜡包埋、抗原修复、染色、免疫标记以及原位杂交[48,49]等过程。微波处理器还被用于快速骨骼脱钙（见图1）。
类似的关于微波辅助电子显微镜🔬样品处理的报道表明，其处理时间短，标本形态得到改善，且用于免疫细胞化学实验的标本抗原性增强。微波辅助树脂聚合已被用于包埋解冻的薄冷冻切片，稀释的抗体经过微波照射后，可提高其在电镜免疫细胞化学中的标记效率。由于这些报道，以及微波处理被纳入实践课程的教学内容，电子显微镜🔬实验室正将微波处理器应用于常规实验方案中。
（三）用于电子显微镜🔬的常规微波辅助处理方案
本章所述方案已在不同实验室使用不同的微波处理器进行了广泛测试，并被证明能产生可重复的结果。我们发现的唯一变量是不同供应商提供的Epon替代品。如果不使用Eponate12，我们提供的Spurr-Epon配方聚合效果会有所不同。不过，似乎所有的Epon替代品都可以使用，但可能需要进行一些调整以优化树脂的硬度。我们建议使用单一供应商提供的完整试剂盒，不要混合使用不同供应商的成分。我们还建议在使用所有树脂混合物包埋标本之前进行测试。
完整的方案可以直接应用，或者像在我的实验室中那样，将方案的部分内容融入现有的长期方案中。例如，我们偶尔会使用微波处理器进行脱水和树脂渗透，但在常规烘箱中于60°C下进行最终的树脂聚合。我们还使用快速树脂聚合来重新包埋需要重新定向以进行切片的聚合标本。微波辅助处理的示例可在本章的图2、图3和图4中查看。所有标本都是使用下面概述并在表1（a）中注释的方案，通过微波辅助固定、脱水和树脂渗透，包埋到环氧树脂中的。所有标本都是使用表2（c）中记录的环氧树脂配方进行渗透的。图2所示的标本是使用3.6节中描述的微波方案在树脂中聚合的。图3和图4所示的标本是在60°C下过夜聚合在树脂中的。
二、材料
（一）设备
1. 用于实验室的微波处理器，具有以下特点：-磁控管预热功能-可变功率-强制气体提取系统-热电偶温度探头-负载冷却器-可编程预设
2. 用于树脂包埋生物标本薄片切片的超薄切片机
3. 工作电压为80kV的透射电子显微镜🔬（TEM），用于检查薄片
4.推荐使用60°C烘箱进行树脂的热聚合
（二）消耗品
1. 玻璃或塑料标本瓶
2. 离心管（1ml和0.5ml规格）
3. 两个500ml玻璃烧杯
4. 乐柏美三明治盒
5. 塑料巴氏吸管
6. 冰桶
7. BEEM胶囊
8. 特氟龙胶囊架或离心管架
9. ParafilmM®（石蜡膜）
（三）化学品
1. 在100mMsodiumcacodylate缓冲液（pH7.2）中的2.5%戊二醛
2. 在100mMHEPES缓冲液（pH7.0）中的4%甲醛
3.2%四氧化锇水溶液
4.100mMsodiumcacodylate，pH7.2
5.100mMHEPES缓冲液，pH7.0
6. 浓度递增的丙酮水溶液（50%、70%和90%）
7. 无水丙酮
8. 电子显微镜🔬用包埋树脂。
这些树脂有试剂盒形式，各个组分可从任何电子显微镜🔬供应公司购买。
三、方法
（一）微波处理器的设置
本章中的方案建议使用商用实验室微波处理器。市售仪器符合处理生物医学实验室中遇到的hazardousmaterials所需的必要安全标准。安装和操作微波处理器时，请遵循制造商的建议，并在连接气体提取系统时特别注意。它必须连接到适合处理挥发性有毒气体的出口。
连接好处理器后，需要在腔内创建一个可对标本进行照射的冷点。在微波腔内放置一个水循环的水箱，即可形成冷点。水负载会吸收微波产生的热量，并在腔底形成一个微波照射分布更均匀的区域。使用氖灯阵列或装满水的小试管🧪阵列测试冷点。
（二）生物标本的化学固定
通常使用戊二醛或甲醛等化学试剂对要进行电子显微镜🔬检查的细胞和组织进行交联固定。将生物材料浸入化学固定剂中，或者将固定剂灌注到整个标本中。成功的交联取决于化学固定剂能否快速渗透并与细胞成分发生反应。化学固定剂的确切作用机制仍未完全明确。微波辅助化学固定的机制则更不为人所知。不过，已有许多报道称一些方案能成功发挥作用。本方案建议采用Giberson和Demaree提出的固定方案。
1.若微波处理器的磁控管连接有温度探头，将温度限制设置为30°C。
2.小心解剖出目标组织，并立即将其浸入2.5%缓冲戊二醛中。用两个薄而平的刀片将标本切成2-3mm³的块，然后将这些块转移到装有新鲜2.5%缓冲戊二醛的玻璃小瓶中。
3.将小瓶在冰上冷却，然后转移到微波腔的冷点。
4.以100%功率照射40秒，然后将其转移到微波腔外的冰上。孵育5分钟。
5.将小瓶放回腔内，再次以100%功率照射40秒。
（三）使用四氧化锇进行后固定
1. 将处理器的温度限制保持在30°C。
2. 移除标本块上方的固定剂，但不要让标本块干燥。加入sodiumcacodylate缓冲液，在微波腔外的冰上孵育5分钟。
3. 移除缓冲液，加入冷的1%四氧化锇水溶液。
4. 以100%功率微波处理40秒。
5. 将小瓶移回处理器外的冰上，在冰上孵育5分钟。
6. 保持标本浸入1%四氧化锇中，将小瓶放回处理器腔，以100%功率微波处理40秒。
（四）脱水
1. 移除四氧化锇，用蒸馏水替换。这只是快速更换，不要让标本长时间孵育。
2. 标本脱水包括将标本暴露于浓度递增的丙酮中。脱水步骤是分别在50%、70%和90%丙酮中各更换一次，然后在100%丙酮中更换两次。
3. 对于每次丙酮溶液的更换，将标本以100%功率微波处理40秒。
4. 每一步后将标本从微波处理器中取出，用下一个更高浓度的丙酮替换当前丙酮。使用LRWhite树脂的方案略有不同，包括用乙醇替代脱水介质。
（五）树脂渗透
1. 将处理器的温度限制设置为45°C。
2. 用等体积的100%丙酮和环氧树脂的混合物替换标本小瓶中的100%丙酮。
3. 以100%功率照射小瓶15分钟。
4. 移除丙酮-树脂混合物，替换为100%树脂。
5. 以100%功率照射15分钟。
6. 移除树脂，加入新鲜的100%树脂。
7. 以100%功率照射15分钟。
（六）树脂聚合
1. 取出标本，将每个块分别放入BEEM胶囊中。BEEM胶囊的盖子应切掉，并牢固地固定在特氟龙架中。此时也可以在管中放入唯一标识符标签。
2. 用含有催化剂的新鲜树脂填充胶囊，并用一小块石蜡膜覆盖顶部。
3. 用之前取下的BEEM胶囊盖子覆盖石蜡膜，并将盖子用力按紧。这一步的目的是密封BEEM胶囊，防止水进入胶囊。
4. 将装有BEEM胶囊的特氟龙托盘放入乐柏美托盘中，并用自来水覆盖胶囊。
5. 将托盘放入微波处理器中，将温度探头放入水中，并将温度限制设置为101°C。
6. 以100%功率微波处理90分钟（60分钟加30分钟）。LRWhite树脂聚合需要更短的微波暴露时间。
7. 取出装有BEEM胶囊和热水的托盘。
8. 将BEEM胶囊从水中取出，让其冷却。
9. 使用刀片或BEEM胶囊压制器，从块上取下塑料模具，准备切片。
四、注意事项
1. 本章中描述的用于快速固定、脱水和树脂包埋的方法已使用常规高功率家用微波炉和市售实验室微波处理器进行了测试。出于安全考虑，我们不建议使用常规高功率微波炉。戊二醛、甲醛、四氧化锇以及用于包埋生物材料的树脂会释放出对人体有害的有毒蒸气。它们只能在通风良好的区域使用，确保烟雾能立即消散。丙酮是易燃的，如果在未经改装和未屏蔽的微波处理器中使用，可能会接触到火源。
2. 如果腔内为空，不应操作微波处理器。这样做可能会损坏磁控管。
3. 所有微波处理器都能加热暴露在微波下的物体。加热情况不可预测，容器内的物质可能会比容器本身热得多。微波照射后从微波处理器中取出物体时应极其小心，所有物体都应被视为有灼伤风险。
4. Login和Dvorak已详细介绍了实验室微波处理器的校准。
5. 热点是微波腔内由封闭腔内产生的共振微波导致的区域。微波产生的驻波分布不均匀，会在某些区域积聚，而在其他区域则不会。
6. 微波腔内的热点可以使用氖灯阵列或液晶温度条（均可从许多电镜供应公司购买）检测。这些指示器能即时、直观地显示热点分布。不过，也可以使用一排装有等体积水的小试管🧪来识别热点。将该阵列放在腔底，以全功率开启处理器一小段时间（例如5秒）。液晶和氖灯阵列会立即发光，指示热点位置。如果使用试管🧪装水，热点会通过试管🧪中水温的升高而显现。尽管不推荐，但聚苯乙烯板也曾被用于检测热点。照射后，熔化的塑料斑块会标识出热点位置！
7. 如果水负载保持不变，冷点的位置也将保持不变。
8. 如果有商用实验室微波处理器，使用烧杯装水来创建冷点的方法已过时，但可能有些用户无法使用封闭式循环水负载。如果使用烧杯装水，Giberson和Demaree建议在600μL体积的水中，以100%功率微波照射40秒，温度变化应超过10°C但低于15°C。如果需要，可以通过增大所用烧杯的尺寸或添加额外的装水烧杯来增加水负载的体积。
9. 水负载可以通过冷水机循环使用，以帮助减少腔内的加热。可以在微波腔底部放置一个扁平的腔体，让冷水循环通过，从而创建冷点（例如，TedPella公司的PelcoColdSpot®）。照射时将标本小瓶放在该腔体顶部。
10. 使用缓冲戊二醛或甲醛进行微波辅助化学交联的机制仍不十分清楚。早期对这一过程的研究难以评估，因为微波暴露时间短，但生物材料随后会在稀释的固定剂中长时间浸泡。
11.用还原锇替换1%四氧化锇可以增加对比度。将含有0.3%亚铁氰化钾的1%四氧化锇水溶液加入标本块中，以100%功率照射40秒。
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