梨（Pyrus spp.）是自交不亲和作物，具有广泛的遗传多样性。高度的杂合性以及技术限制导致参考基因组中存在缺口。2025年8月6日，南京农业大学吴俊教授团队在Nature Genetics上在线发表了题为Haplotype-resolved, gap-free genome assemblies provide insights into the divergence between Asian and European pears的研究论文。该研究以亚洲梨和西洋梨的代表性品种‘砀山酥梨’和‘红巴梨’为试材，构建了高质量无缺口单倍型分型基因组，通过基因组，GWAS，转录组等分析，揭示了梨自交不亲和、果实品质和产量等重要农艺性状密切相关的结构变异与关键功能基因。本研究揭为梨的遗传改良提供重要参考。
1.梨的单倍型T2T基因组组装
为揭示亚洲和西洋梨的遗传差异和分化机制，作者选择PacBio HiFi、ONT超长读长及Hi-C数据对‘砀山酥梨’（DS）和‘红巴梨’（MRB）进行单倍型组装。每条单倍型均被组装为17条连续体，对应梨的17条染色体，大小介于497.50–505.55 Mb，contig N50 ≥28.96 Mb（表1）。与已发表的基因组相比，新组装额外获得了18.89–24.13 Mb的序列。contig N50、比对率、BUSCO及LTR组装指数均显示组装质量极高。在DS和MRB的单倍型17条染色体末端分别鉴定到34和33个端粒（图1a,b）。成功获得了DS和MRB的T2T、单倍型解析基因组。DS和MRB单倍型中重复序列长262.86–272.23 Mb（表1），以LTR为主。预测蛋白编码基因为42,675–43,602个，BUSCO完整度97.90–98.60%。高质量的组装和注释结果为研究复杂区域(包括着丝粒和S位点等位基因)(图1c,d)提供了机会。此外，DS的HapA（HapB）新组装区含577（563）个基因，MRB的HapA（HapB）含697（804）个基因；其中77.33–84.06%位于高TE、高甲基化区，表明这些区域曾被遗漏。
图1 DS和MRB基因组组装
2.单倍型特异性基因与等位基因特异性表达（ASE）的鉴定
长期的杂交导致梨两个单倍型间积累了大量遗传变异基于对应单倍型中同源基因的存在，33,710-34,036个不具有相同编码序列(CDS)的同源基因被定义为双等位基因(图2a,b)。作者进一步在各单倍型中鉴定到1,703–1,994个没有等位基因的单倍型特异性基因。与双等位基因相比，这些单倍型特异性基因在基因上下游5 kb及基因体内的转座元件（TE）含量更高（图2c），且在DS和MRB不同果实样本中的平均表达量显著更低。甲基化分析表明，单倍型特异性基因在叶片和成熟果实的基因体及±5 kb区域内DNA🧬甲基化水平更高，提示甲基化介导的转录抑制。KEGG富集分析显示，这些基因显著富集于“植物–病原互作”和“环境适应”通路，GO分析则富集于“响应生物刺激”。在DS和MRB八个果实阶段（5个发育期＋3个采后期）的RNA-seq分析中，分别有19.64%（8,511/43,330）和26.21%（11,213/42,784）的基因至少在一个样本中表现出ASE（图2d）。这些ASE基因被进一步划分为三类（方法）： 4,498（DS）/4,953（MRB）个“单倍型显性”（HapDom，某一等位基因显著高表达）；219/527个“亚/新功能化”（Sub，不同样本中优势等位基因互换）；3,794/5,733个其他ASE（NoDiff）。仅44.52%的DS-ASE基因在MRB中保持ASE模式（图2e）。注释了380（DS）和450（MRB）个与果实性状相关的ASE基因，涵盖糖转运（SWEET2）、酸代谢（MDH）、木质素合成（C3H、4CL）等通路。95.26%（DS）和88.89%（MRB）的果实性状相关ASE基因表现为单倍型显性，说明优势等位基因对品质影响更大（图2h）。
图2 DS和MRB的等位基因变异及表达模式
3.亚洲梨与西洋梨的基因组演化
为了探索亚洲梨（DS）和西洋梨（MRB）的演化历史，将 DS、MRB 与另外 10 个物种的蛋白编码基因进行系统发育分析（图 3a）。系统发育分析表明，DS 与 MRB 在大约 360 万年前（Ma）分化。与共同祖先相比，DS 中 767 个、MRB 中 740 个基因家族发生扩张。DS 扩张家族富集于“植物次生代谢物合成”“植物–病原互作”以及“胁迫响应”等通路，而 MRB 扩张家族则主要与“果糖与甘露糖代谢”“碳水化合物代谢”和“次生代谢过程”相关。亚洲和西洋梨之间广泛的进化分歧意味着它们之间存在显著的基因组变异（SV）(图3b)。
四个单倍型进行SV鉴定，共鉴定并分型 103,069 个 SV，其中 57.42% 位于基因区或调控区（±2 kb），61.27% 与 TE 重叠（图 3c）。发现 12 个大于 100 kb 的倒位，总长度 5.79 Mb，均获得 ONT 读段或 Hi-C支持（图 3d ）。值得注意的是，第 17 染色体 S 位点区域存在 0.58 Mb 倒位，可能抑制重组，维持 SFB 与 S-RNase 基因连锁，确保自交不亲和性（图 3d）。为进一步挖掘亚洲与西洋梨的群体差异，作者将 362 份重测序材料映射至图形基因组进行 SV 分型。随着样本量增加，分型 SV 数趋于饱和（图 3e）。最终保留 83,369 个高质量 SV（MAF > 0.05，缺失率 < 0.2）。其中 76.82% 的 SV 在亚洲梨群体中参考基因型频率 > 0.5，42.73% 在西洋梨群体中频率 > 0.5；共 35,481 个 SV 在两群体间呈现显著频率差异（FDR < 0.001 且 fold-change > 2）（图 3f）。
图3 DS和MRB之间的差异和SVs
4.演化历史与遗传渐渗
基于SNP与SV分别构建的系统发育树均将362份梨种质清晰地分为两大支系：分支I包括大多数亚洲梨，分支II包括西洋梨（图4a）。分支一进一步分为4个亚支：(1) 白梨/砂梨（P. bretschneideri & P. pyrifolia）；(2) 亚洲野梨；(3) 野生与栽培秋子梨（P. ussuriensis）；(4) 新疆梨及种间杂种。分支II细分为两个亚分支：(5) 西洋梨（P. communis）；(6) 西洋野梨。高固定统计量(FST)和主成分分析结果支持亚洲和西洋梨之间的长期分化历史(图4b）。栽培秋子梨的核苷酸多样性高于野生秋子梨。Structure分析揭示栽培梨历史上曾发生多次杂交：栽培秋子梨同时携带野生秋子梨与栽培白梨/砂梨的血统（图4a）。Treemix分析检测到从白梨向栽培秋子梨基因流，表明基因渗入事件可能在秋子梨的驯化中发挥了作用。效群体大小（Ne）推演显示，亚洲野生群体（除野生秋子梨外）和西洋野生群体均经历过三次Ne下降（图4c）。
第一次下降事件发生在2.5-1.7 Ma，即Gelasian时期(2.59-1.81 Ma)，以温度急剧下降为特征。第二次Ne下降事件发生在1.0-0.6 Ma，伴随着另一个温度下降期，最后一次下降发生在250至160 ka。随后150–10 ka间伴随气候回暖迅速扩张。而野生秋子梨仅经历两次Ne下降，第二次始于380 ka，180 ka后略有回升，导致其Ne长期低于其他野生群体。
图4 362份梨种质资源群体分析及亚洲和西洋梨选择驯化分析
5.梨果实品质的选择信号
从野生祖先到栽培品种，梨在糖、酸、石细胞含量及果实大小等性状上发生显著改变。作者鉴定了AW对亚洲栽培(AC，包括P. pyrifolia和P. bretschneideri)梨的21.31 Mb选择性清除区域和EW对西洋栽培(EC；P. communis)梨的14.59 Mb选择性清除区域(图4d,e)；在选择性清除中鉴定到123个与果实大小、植物发育、石细胞含量、酸和糖相关的选择基因。 第16染色体上存在强烈的AW vs AC选择信号，囊括Ma1（苹果酸转运）、fw2.2（细胞分裂调控）和SWEET15（糖转运）等基因（图4d）。苹果中Ma1与fw2.2同源基因亦处于栽培选择区，提示梨与苹果在酸度和果形上经历了趋同选择。
石细胞含量(SCC)是梨驯化中的一个关键性状。SCC在果实发育早期形成，并与木质素和纤维素的形成相关。在亚洲梨驯化中，在AW对AC梨的选择性清除中鉴定到11个与木质素和纤维素形成相关的结构基。PbrbZIP48(Pbre1_16G094200)调控石细胞相关基因的表达，在AC梨的选择性清除中被鉴定到(图4d)。在选择清除中鉴定到的PbrmiR397a可以沉默LAC基因的表达，从而降低梨果肉中的木质素和石细胞含量。这些结果表明，结构基因、转录因子和microRNAs(miRNAs)可能与石细胞形成相关，可能在梨驯化过程中被平行选择以减少果实中的SCC。这些选择或共同选择的基因为理解驯化过程和促进梨育种提供了有用的遗传资源。
6.与农艺性状关联的结构变异（SV）
前人研究表明，SV 可直接导致农艺性状差异。基于 83,369 条高质量 SV，作者对果实横径（FTD）、可溶性固形物（SSC）、石细胞含量（SCC）和单果重（SFW）开展 SV-GWAS：
在第 2 染色体发现 66 bp 缺失，与 FTD 极显著关联（P = 1.16 × 10⁻¹³，图 5a）。 该缺失位于 AC 梨选择清除区（图 5b），在 P. pyrifolia 和 P. bretschneideri 中的出现频率显著低于野生群体（图 5c）。 无缺失的梨种质比有缺失的种质具有显著更高的FTD(图5d)。 下游候选基因 PyTPR（编码四肽重复蛋白）参与植物发育和纤维伸长；无缺失的种质比有缺失的种质具有显著更高的PyTPR表达水平（FPKM 497.33 vs 81.85，图 5f）。结果表明，PyTPR在亚洲梨驯化过程中受到选择，并可能在梨FTD和果实发育中具有潜在作用。
图5 FTD和SSC的GWAS分析
第 15 染色体发现 1,016 bp 缺失，与 SSC 显著相关（P = 3.70 × 10⁻⁹，图 5g）。缺失型个体 SSC 显著高于无缺失型（图 5h）。 候选基因 PybZIP6（bZIP 转录因子）在果实发育后期（S3–S5）高表达，暗示其促进糖积累（图 5j）。 该缺失在 P. communis 群体中的频率显著高于 EW 群体（图 5k）。基于SV的GWAS为改善梨栽培品种的果实品质提供了新的标记。
7.PyACS1 在西洋梨果实成熟与软化中的功能
邻近 SV 可通过干扰调控区或基因本体而改变表达。作者利用 110 份转录组（62 份亚洲梨、38 份西洋梨、10 份种间杂种）鉴定 SV 对基因表达的影响，发现 4 040 个启动子区 SV 和 568 个外显子区 SV 与表达显著关联（图 6a）。其中 70.79% 和 65.49% 在亚洲与西洋群体间呈显著差异分布，提示 SV 可能在群体间调控基因表达。
与亚洲梨相比，西洋梨通常被归类为呼吸跃变型果实，乙烯的产生负责果实成熟和软化的启动与进展。本研究鉴定出 5 个具有结构变异的乙烯生物合成相关基因，其中一个编码 1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶（PyACS1）的基因（Pbre1_15G535800）是乙烯合成的限速酶。转录组分析表明，PyACS1 在西洋梨中的表达量显著高于亚洲梨（图 6b）。种间杂交品种的表达水平高于亚洲梨和西洋梨，这表明在这些杂交品种中可能存在超显性表达模式。PyACS1 基因仅在 MRB 的果实发育后期（S4 和 S5）以及三个采后（S6-S8）阶段高表达，而 DS 的 8 个阶段均几乎不表达（图 6c）。过表达 PyACS1（OE-PyACS1）的番茄植株果实成熟加快（图 6d、e），乙烯含量更高（图 6f），硬度更低（图 6g），这表明 PyACS1 促进果实成熟和软化。在 PyACS1 的启动子区域发现了一个 286 个碱基对的插入序列，该序列存在于所有西洋梨和种间杂交品种中，但在亚洲梨中不存在（图 6h-j）。WGCNA分析，在 PyACS1 基因共表达模块中鉴定出一个基本螺旋-环-螺旋转录因子（PybHLH94）。在烟草原生质体中进行的双荧光素酶（LUC）转录检测表明，PybHLH94 能够显著激活 PyACS1proMRB（含 286 个碱基对插入），但不能激活 PyACS1proDS（不含 286 个碱基对插入），这表明存在插入依赖性的转录调控（图 6k）。启动子截短实验结果表明，激活发生在 -1221 个碱基对至 -830 个碱基对的区域内，该区域包含 286 个碱基对的插入序列（-1141 个碱基对至 -855 个碱基对）（图 6l ）。这表明 PybHLH94 能够通过与 286 个碱基对的插入序列结合来特异性激活 PyACS1 的启动子。电泳迁移率变动分析（EMSA）结果表明，PybHLH94（His）可直接与 286 个碱基对插入序列中的 G 盒和 E 盒结合（图 6m）。
图6 SVs与西洋梨果实成熟和软化的基因表达及功能影响相关
本研究完成了代表性亚洲梨品种‘砀山酥梨’和西洋梨品种‘红巴梨’的端粒到端粒（T2T）、单倍型解析的完整基因组。单倍型特异性基因在转座元件含量、甲基化模式和表达水平上与双等位基因存在显著差异。等位基因特异性表达分析表明，显性效应对梨果实品质的形成至关重要。对362份梨种质的群体分析显示，种间渐渗增加了梨的遗传多样性。作者构建了基于图结构的泛基因组，并鉴定了与农艺性状相关的结构变异。研究发现，在亚洲梨和西洋梨中，PyACS1基因启动子区存在一个286 bp的插入序列差异，该差异与其不同的果实软化特性相关，且PyACS1基因的表达水平也存在差异。进一步的实验证实了PyACS1在果实软化中的作用。本研究揭示了梨的遗传变异机制，将为梨的遗传改良提供重要参考。
