生物化学与生物物理进展 ：《重组人源化胶原蛋白在生物医药方面的应用》
胶原蛋白是哺乳动物体内分布最广、含量最多的功能性蛋白，按来源可将其大致分为动物胶原蛋白和重组胶原蛋白，动物结缔组织是提取动物胶原蛋白的主要途径，而重组胶原蛋白是利用基因拼接技术将所需人胶原蛋白基因克隆到适宜的载体后转移到表达体系内表达，再提取纯化生产的蛋白质。重组胶原蛋白的组织相容性极好，可直接被人体吸收并参与胶原的构建，对细胞生长及伤口愈合等都显著有效，是现代生物医药材料的开发重点。
本文简述了胶原蛋白的结构、类型和生产，重组胶原蛋白表达体系，重点阐述了利用动物疾病模型，探索重组胶原蛋白在创口止血、创面修复、角膜治疗、女性♀️盆底功能障碍（FPFD）、阴道萎缩（VA）和阴道干燥、薄型子宫内膜（TE）、慢性子宫内膜炎（CE）、体内骨组织再生、心血管疾病、乳腺癌（BC）及『抗衰老』方面的应用效果，并介绍了重组胶原蛋白治疗FPFD和CE的作用机制，总结了重组胶原蛋白在皮肤烧伤、皮肤创口、皮炎、痤疮及更年期泌尿生殖系统综合征（GSM）方面的临床应用及疗效。最后简述了重组胶原蛋白面临的挑战，并对重组胶原蛋白的发展和应用前景做出展望。
1、结构与分类
胶原蛋白的基本单元为原胶原，由三条左手α链缠绕成右手超螺旋结构，其典型氨基酸序列为（Gly-X-Y），其中X、Y常为脯氨酸和羟脯氨酸。
目前已发现28种胶原类型（表1），按结构和功能可分为成纤维胶原（如I、II、III型）和非纤维胶原（如IV、VI型等）。胶原突变可导致多种遗传病，如埃勒斯-当洛斯综合征（EDS）、骨关节炎（OA）、Alport综合征等。
2、生产方法
动物胶原提取常用酸法、酶法及超声辅助法，但存在病原风险、批次差异大等问题。重组胶原通过基因工程在毕赤酵母、大肠杆菌等系统中表达，产量高、纯度好，且可实现特定类型胶原（如III型、I型）的规模化生产（表2）。
3、生物医药应用
重组胶原蛋白受到了研究者们的瞩目，正在被不断地开发利用。本文总结了近年来众多研究者对重组胶原蛋白在生物医学方面的探索研究（表3）和临床应用（表4），其中少部分作用机制已被发现，为重组胶原蛋白的进一步研究开发提供了更多可能性。
4、重组胶原蛋白在创口止血及皮肤损伤修复中的应用
4.1 创口止血
◆ 重组III型人源化胶原蛋白凝胶敷料应用于大鼠肝损伤研究中发现，该敷料可显著减少出血时间、出血量及肝脏病理损伤。
◆ 重组I型胶原止血海绵🧽用于治疗兔肝出血，发现其在体内可完全生物降解，无不良反应，止血效果良好。
4.2 皮肤烧烫伤
◆ 重组人源化胶原蛋白制备促烧烫伤愈合材料，并涂抹于深II度烫伤大鼠创面，发现其可强化微血管强度和弹性，同时直接与血管母细胞结合促进新血管形成，改善创面微循环，减轻炎症反应，促进创面愈合。
◆ 对深II度烧伤患者进行创面磨痂术治疗后，实验组涂抹重组人源胶原蛋白凝胶研究表明组伤口闭合速度更快，创面分泌物少，瘢痕率低。临床应用后的良好反馈为重组胶原蛋白广泛治疗皮肤烧烫伤提供了重要支撑。
4.3 慢性伤口
◆ 一种由海藻酸钠、二氧化锰纳米颗粒、重组人源化III型胶原蛋白和间充质『干细胞』 （MSCs） 组成的复合水凝胶，体内研究证明，该水凝胶可促进糖尿病创面愈合、快速再上皮化、加快胶原沉积和创面血管生成。
◆ rhCol III与莫巴拉链霉菌的谷氨酰胺转氨酶（TG）交联，并装载细胞外囊泡（EV），形成rhCol III-ev水凝胶，用于治疗糖尿病大鼠，证明其可局部缓释EV，促进创细胞的抗炎、增殖、迁移和成管能力，加速组织再生。
4.4 急性创面
◆ 以1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）/N-羟基丁二酰亚胺（NHS）交联的重组人III型胶原为基础，制备含整合素受体的纳米纤维膜创面敷料，用于小鼠全层创面后发现，该敷料可加速创面愈合，改善胶原沉积，恢复真皮、表皮结构及皮肤附属物。
◆ 引入明胶甲基丙烯酰（GelMA），与重组人III型胶原蛋白制成GelMA-rhCoIII水凝胶，植入大鼠全层切除伤口，发现其可模拟皮肤组织微环境，加速皮肤的修复和再生。
◆ 一种由甲基丙烯酸缩水甘油酯重组I型胶原蛋白、甲基丙烯酸壳聚糖和氯化铜等制成的水凝胶，用于大鼠全层皮肤缺损模型，证明其可持续释放Cu2+，提供抗菌和血管化特性，短时间内促进肉芽组织形成和胶原沉积，加快急性伤口愈合。
◆ 给乳腺良性肿块切除术患者涂抹重组人源胶原蛋白功能敷料，研究表明，术后创口色素沉着、皮肤瘙痒发生率及瘢痕评分显著降低。
◆ 皮肤创口患者使用重组人源III型胶原蛋白功能凝胶后，创面局部III型胶原水平提高，组织增生及瘢痕生成减少，色素沉淀降低（图4）。
图4 重组胶原蛋白修复创伤
创伤形成后，修复机制启动，局部使用重组胶原蛋白可增加创伤处胶原蛋白的含量，改善胶原沉积，同时巨噬细胞释放转化生长因子β1（TGF-β1）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、VEGF等因子，促进肉芽组织生长，其中TGF-β1促进纤维母细胞增生，PDGF刺激纤维母细胞生长，VEGF调节血管生成，加快创面修复.
4.5 口腔溃疡
◆ 在大鼠口腔溃疡模型中使用重组人源化XVII型胶原蛋白（rhCol XVII）制成的喷雾剂，可显著降低炎症水平，增加转化生长因子β（TGF-β）、表皮生长因子（EGF）和VEGF表达，促进新生血管形成和胶原沉积，加快黏膜上皮恢复，促进溃疡愈合，因此rhCol XVII有望成为治疗口腔溃疡愈合的新材料。
◆ rhCol III在体外促进人口腔角质形成细胞的增殖、迁移和黏附，在小鼠口腔溃疡模型中，rhCol III能加速口腔溃疡的愈合，减少炎症因子释放，减轻疼痛，机制上，与Notch信号通路相关的基因在rhCol III处理后富集上调，但rhCol III对口腔溃疡的具体治疗机制还有待更进一步的研究。
4.6 大疱性表皮松解症（EB）
◆ 将重组VII型胶原蛋白用于隐性营养不良性EB小鼠，发现其可融入DEJ并恢复VII型胶原蛋白和锚定原纤维，同时纠正真皮-表皮分离，从而缓解EB的起泡症状（图5）。
图5 重组VII型胶原蛋白治疗EB（a）正常皮肤；（b）正常皮肤局部结构；（c）EB，基底膜区与真皮处发生分裂，锚定纤维数量减少；（d）重组VII型胶原蛋白使基底膜区与真皮处分裂缩小至消失，锚定纤维数量增多.
4.7 皮炎
◆ 用含有重组人源化胶原蛋白的组合物滴注给药于湿疹大鼠，研究表明，该组合物可降低白介素-4的表达，有效缓解皮肤症状并恢复皮肤光泽。
◆ 给面部激素依赖性皮炎患者涂以重组III型人源化胶原蛋白修复软膏，发现治疗总有效率高，皮肤屏障功能得到改善。
◆ 对皮炎患者使用医用重组人胶原蛋白功能敷料（MRHC）和医用愈肤生物膜膏剂活性敷料（MSHB）联合治疗，与单独使用MSHB相比，联合治疗后患者面部修复效果更显著，表明MRHC有抑菌、抗炎和修复皮肤屏障作用。
4.8 痤疮
◆ 在强脉冲光治疗面部痤疮术后的临床疗效研究中，证明医用重组人源胶原蛋白功能敷料贴比传统冰敷和动物胶原蛋白敷料贴效果更好。
◆ 利用精准脉冲光联合重组人源III型胶原蛋白敷料治疗玫瑰痤疮，与仅使用精准脉冲光治疗比较发现，联合治疗后患者面部修复效果更显著，证明重组人源III型胶原蛋白敷料可保护并修复痤疮患者的皮肤屏障。
5、重组胶原蛋白在角膜治疗中的应用
◆ 将重组人胶原III型（RHCIII）水溶液、2-吗啉乙磺酸和2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱（MPC）等原料依次加入注射器💉混合系统中，0℃下制备RHCIII-MPC水凝胶，交联完成后脱模清洗，装瓶于磷酸盐缓冲液（PBS）或含1%氯仿的PBS（CPBS）中，PBS瓶用17kGy电子束辐照，将C-PBS和17kGy辐照的植入物用于兔体内，研究表明，植入物成功实现了再上皮化，提高了角膜上皮、基质和神经的再生能力，在角膜治疗上展现出巨大潜力。
6、重组胶原蛋白在妇科疾病中的应用
6.1 女性♀️盆底功能障碍
◆ 将重组人I、III胶原蛋白（rhCOL）衍生材料注射给FPFD大鼠，研究表明，rhCOL可促进I、III型胶原及基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）的表达，并激活FAK/RhoA/ROCK信号通路，增强阴道拉伸能力，具有很大的临床应用潜力（图6）。
图6 rhCOL治疗FPFDrhCOL通过激活局灶性黏附激酶（FAK）并使其磷酸化，磷酸化的FAK与黏着斑蛋白（vinculin）结合后参与细胞下游的信号转导，激活RhoA/ROCK信号通路，增加纤维肌动蛋白（F-actin）表达，促进细胞的黏附和迁移，增加ECM中I、III胶原蛋白含量，重塑FPFD大鼠阴道ECM，并修复其组织结构，恢复阴道生物学抗性.
◆ 在FPFD大鼠阴道注射重组I型人源化胶原蛋白，可促进FPFD大鼠尿道动力学的恢复，改善阴道生物力学抗性。
6.2 阴道萎缩（VA）
◆ 用T16胶原阴道治疗卵巢切除大鼠，研究表明，其可上调阴道TIMP-1及VEGF等因子的水平，增厚阴道上皮，增加ECM成分，是一种治疗VA非常有前景的方法。
6.3 宫颈炎
◆ 用重组胶原蛋白妇科凝胶治疗宫颈炎大鼠，研究表明，重组胶原蛋白组可缓解阴道口红肿，减少分泌物，降低炎症反应，且高浓度组治疗效果更显著。
6.4 薄型子宫内膜（TE）
◆ 含有重组III型胶原和MSCs的复合海藻酸盐水凝胶，在薄型子宫内膜小鼠模型中，该水凝胶可增强小鼠子宫内膜基质细胞（ESCs）的活力和迁移能力，增厚子宫内膜，促进腺体和血管生成，在诱导体内子宫内膜再生和增强生育能力，促进子宫内膜功能的恢复中表现出巨大潜力。
6.5 慢性子宫内膜炎（CE）
◆ 在体外建立M1巨噬细胞和M1巨噬细胞培养基和脂多糖（LPS）共同刺激的炎性ESCs，以模拟CE条件，加入rhCol III后发现，M1巨噬细胞向M2表型迁移，炎症性ESCs的迁移、活力得到改善和胶原成分发生变化，此外，炎症性胚胎『干细胞』的炎症反应在rhCol III治疗后也降低，用rhCol III体内灌注CE大鼠的子宫内膜发现，rhCol III可与盘状蛋白结构域受体（DDR1/2）相互作用，同时抑制NF-κB/YAP信号通路，降低炎症反应，重塑ECM，恢复其生育能力（图7），但研究并未证明NF-κB和YAP之间的信号联系，NF-κB和YAP在信号传递过程中是否互相影响还需更多的实验证明。
图7 rhCol III治疗CE
体外实验中，LPS刺激M1巨噬细胞后，激活NF-κB的表达，IκBα和p65被磷酸化，炎症反应发生，促炎因子Toll样受体4（TLR-4）和白介素-6（IL-6）表达增多，抗炎因子白介素-10（IL-10）表达降低，rhCol III通过免疫调节M1巨噬细胞极化到M2表型，从而表现出对NF-κB激活的抑制作用，IκBα和p65表达减少，炎症反应降低，诱导YAP磷酸化，YAP水平降低，同时，LPS刺激后的炎性胚胎『干细胞』在rhCol III作用下，NF-κB/YAP信号通路被抑制，rhCol III还与DDR1/2受体相互作用，增强细胞的增殖和迁移能力，并调节细胞代谢。rhCol III体内灌注CE大鼠的子宫内膜后，rhCol III通过抑制大鼠的NF-κB/YAP信号通路，调节巨噬细胞由M1表型转化为M2，减少炎症浸润，子宫内膜容受性标志物HOXA10表达增多，重塑子宫ECM，恢复其生育能力.
◆ 在CE大鼠子宫内注射重组III型人源化胶原蛋白，可抑制炎症反应，同时重塑ECM，增加子宫内膜容受性，改善子宫内膜微环境。
6.6 更年期泌尿生殖系统综合征（GSM）
◆ GSM患者阴道给予重组人源胶原蛋白阴道凝胶后，发现阴道湿润度增加，瘙痒及灼热感降低，阴道弹性提高。还有研究表明，患者于术前在阴道内均匀涂抹重组人源胶原蛋白，疗程结束后发现，阴道上皮厚度大，I、III型胶原蛋白表达率高，阴道壁平滑肌组织排列更整齐。
7、重组胶原蛋白在骨缺损中的应用
◆ 将新型重组人胶原蛋白（rhCol）与TG交联，并负载bFGF制备了rhCol/bFGF水凝胶，用其治疗大鼠颅骨缺损后证实，rhCol/bFGF水凝胶可促进细胞增殖、迁移和黏附，并可控性释放和降解bFGF，具有促进骨缺损修复作用，这给骨缺损导致残疾或缺陷的患者带来了福音。
8、重组胶原蛋白在心血管疾病中的应用
◆ 利用姜黄素（Cur）和重组人源型胶原III（rhCol III）合成可注射水凝胶，发现它能控释Cur，提高α肌动蛋白和间隙连接蛋白的表达，使心肌梗死后心功能迅速恢复。
◆ 将重组人III型胶原与HA通过逐层组装沉积在衬底上，形成模拟ECM的多层涂层，将该涂层的聚乳酸支架植入兔腹主动脉血栓模型中，研究证明其无明显组织炎症反应，并可促进内皮细胞增殖，同时抑制新内膜过度增生。
◆ 将重组人源化III型胶原（rhCol III）连接在由聚『多巴胺』（PDA）和聚乙烯亚胺（PEI）共聚制备的富胺表面上，制成（rhCol III/PDA-PEI）n涂层，在兔模型中，（rhCol III/PDA-PEI）2涂层可通过促进M2巨噬细胞极化、加速内皮化过程和抑制平滑肌细胞从合成表型向分泌表型的转变来减少炎症反应，从而减少再狭窄并促进支架的长期通畅，在猪模型中，新内膜覆盖于支架，从支架动脉的整个段来看，比市售RAPA支架上形成的支架更薄，这些结果表明，（rhCol III/PDA-PEI）n涂层有利于体内内皮化的正常发育，并显示出实现血管理想重塑的潜力。
9、重组胶原蛋白在癌症治疗中的应用
◆ 用rhCOL III处理人正常乳腺上皮细胞MCF-10A、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺腺癌细胞SK-BR-3和人乳腺癌细胞MDA-MB-231，发现rhCol III可将『肿瘤』细胞保留在休眠期，同时保证正常乳腺上皮细胞的生长；将表达或不表达rhCol III的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231接种到裸鼠的乳腺脂肪垫中，比较发现，rhCol III组的解剖『肿瘤』更小，DDR1、p62蛋白表达水平更高，自噬相关蛋白LCII/I比值低，为BC的治疗提供了理论依据。
10、重组胶原蛋白在『抗衰老』中的应用
◆ 采用重组人源胶原蛋白（RHC）对衰老小鼠进行干预，研究证明，RHC具有抗皮肤衰老功效，高浓度RHC的效果更显著。
◆ 一种高生物活性的四（羟甲基）氯化磷交联重组胶原蛋白水凝胶植入物，在光老化小鼠皮肤模型中，发现该水凝胶植入物可改善真皮密度、皮肤弹性，减少经表皮水分流失，为成纤维细胞活性和胶原蛋白再生创造了有利环境，同时它还可提高超氧化物歧化酶活性，并显示出显著的抗钙化特性。这些研究表明，重组胶原蛋白可促进皮肤中胶原蛋白的分泌，从而重塑ECM，这也为美容和再生医学提供理论依据。
结束与展望
当前重组胶原蛋白以I、III型为主，功能较为单一。未来需开发更多类型的重组胶原，拓展其应用范围；优化剂型设计，如构建载药水凝胶、纳米球等缓释系统；加强作用机制研究，明确信号通路如NF-κB/YAP、FAK/RhoA等在治疗中的作用。尽管大部分研究仍处于动物实验阶段，但重组胶原蛋白在生物医药领域展现出广阔前景，有望成为安全、高效的新型治疗材料。
