滤膜法
一种基于滤膜截留的微生物检测方法
滤膜法是通过特定孔径的滤膜截留流体中微生物颗粒，结合培养与计数实现检测的技术。其核心原理依靠滤膜的选择透过性，水样或空气样本经真空抽滤后，微生物被截留于滤膜表面，转移至培养基培养后通过菌落形态鉴别和计数推算微生物浓度。该方法适用于杂质较少的水样（如饮用水、地表水）检测，同时扩展至空气浮菌数及医疗器具消毒效果监测领域 [2] [4] [6]。技术优势体现在灵敏度高、样本处理量大（可达500ml）及操作标准化，被纳入HJ 347.1-2018、GB 5749-2022等国家检测标准 [2-3] [7]。
标准编号
HJ 347.1-2018 [2] [7]
适用对象
水样、空气浮菌 [4]
滤膜孔径
0.45μm [6-7]
检测耗时
24-48小时 [6]
目录
- 1技术原理
- 2操作流程
- 3应用领域
- 4技术规范
技术原理
- 选择性截留机制滤膜根据检测对象选择孔径（通常为0.45μm），通过真空负压驱动样本穿过滤膜，直径大于孔径的微生物被截留于膜表面，而液体或气体通过 。该过程可实现微生物富集，提升低浓度样本检测灵敏度。
- 培养基鉴别功能微生物截留后，滤膜转移至选择性培养基（如伊红美蓝培养基或MFC培养基），目标微生物代谢产物与培养基成分反应形成特征显色菌落。例如大肠杆菌在EMB培养基上呈现深紫色金属光泽菌落
操作流程
- 样本预处理水样需消除余氯干扰（硫代硫酸钠中和），空气样本采用撞击式采样器收集浮菌。医疗器具检测需使用无菌洗脱液冲洗表面获取样本
- 过滤装置灭菌采用干热灭菌处理滤杯、滤瓶等组件，滤膜经高压蒸汽灭菌后组装。过滤体积依据样本洁净度调整，污染较重样本需稀释后过滤。
- 滤膜转移培养滤膜平铺于固体培养基表面，培养条件根据目标微生物设定（如粪大肠菌群需44.5℃培养24小时）。菌落计数时需区分目标菌落特征，空气浮菌检测可跳过培养直接显微观察
应用领域
- 水质检测涵盖生活饮用水总大肠菌群检测（GB 5749-2022）、地表水粪大肠菌群测定（HJ 347.1-2018）及工业废水微生物监测。每升水样检出限可达2CFU，满足饮用水卫生标准验证需求
- 空气浮菌监测配合空气采样器收集悬浮微生物，采用滤膜法富集后通过显微计数或培养计数评估空气质量。检测流程包含分层采样、鲁哥氏液固定及滤膜透明处理 。
- 医疗器具检测依据GB15982-2012对内镜、透析用水等医疗相关样本进行微生物检测，标准规定使用50ml洗脱液过滤可提升检测代表性，替代传统涂布法的10ml样本限制 。
技术规范
- 质量控制要求每批次检测需设置空白对照（灭菌水过滤）与阳性对照（标准菌株测试），培养基需通过生长试验验证选择性。平行样相对偏差需≤20%
- 仪器校准标准真空泵压力需维持在50kPa以下防止微生物损伤，显微镜🔬需定期校准目镜测微尺。滤膜装置密封性需通过压力保持测试验证
- 干扰消除措施含重金属水样需添加EDTA络合剂，高浊度样本需预过滤去除悬浮颗粒。培养温度波动需控制在±0.5℃以内
膜过滤法是一种经典的微生物检测技术，它通过物理过滤的方式，将液体或气体样品中的微生物富集到一张特定的滤膜上，然后进行培养和计数。这种方法因其高灵敏度、高准确性而被广泛应用于制药、食品、环境监测等多个领域。
一、核心原理
膜过滤法的基本原理非常简单却非常高效：
利用一张微孔滤膜（通常孔径为0.22µm或0.45µm）作为屏障，通过真空或泵压，使供试品溶液通过滤膜。
- 截留：样品中体积大于滤膜孔径的微生物（细菌、霉菌、酵母菌等）会被截留在滤膜的表面。
- 通过：液体及溶解性小分子物质则顺利通过滤膜，进入废液容器。
这样，就将可能存在于大量样品中的少量微生物 “富集” 到一张小小的滤膜上，极大地提高了检测的灵敏度和准确性。
二、主要优势
与直接接种法、平板计数法等相比，膜过滤法具有显著优势：
优势说明🦠 检测大体积样品可以处理数升至数百毫升的样品，能检测出极低浓度的微生物（如1个菌/100mL）。🧪 去除抑菌性对于含有抗生素、防腐剂等抑菌成分的样品（如眼药水、注射液），过滤后可以通过冲洗滤膜来有效去除抑菌性，避免假阴性结果。这是其最关键的优势之一。🎯 提高灵敏度与准确性将微生物富集于滤膜表面，菌落在培养后直接在膜上生长，易于观察和计数，结果更可靠。📊 适用范围广适用于水样、可溶性药品、油性制剂、空气样品等多种类型的样品。⏱️ 快速高效过滤后可直接将滤膜贴附在选择性培养基上，或转入液体培养基中，操作相对简便。
三、标准操作流程
其标准操作流程可以清晰地概括为以下几个核心步骤：
“准备组装
安装滤膜与过滤装置”
“样品过滤
使样品通过滤膜”
“冲洗滤膜
使用无菌缓冲液冲洗”
“转移与培养
将滤膜移至培养基”
“结果判读
培养后计数或观察”
步骤解析：
- 准备与组装：
- 将整套过滤装置（滤杯、底座、滤膜、收集瓶等）进行灭菌（通常采用高压蒸汽灭菌）。
- 在无菌条件下，用无菌镊子将一张无菌滤膜（光面朝上）放置在过滤底座的支持网上。
- 组装滤杯，并将其与真空泵或集菌仪连接。
- 样品过滤：
- 将待测样品注入上部的滤杯中。
- 启动真空泵或集菌仪，施加负压或正压，使样品溶液通过滤膜。
- 所有微生物被截留在滤膜表面。
- 冲洗滤膜（关键步骤）：
- 为了去除样品中可能存在的抑菌成分，在样品过滤完毕后，向滤杯内注入适量的无菌稀释剂（如生理盐水、蛋白胨缓冲液），并进行多次冲洗。
- 冲洗量和次数需经过方法验证确定。
- 转移与培养：
- 方式一（菌落计数）：用无菌镊子将滤膜取出，贴附在含有固体培养基的平板表面（如营养琼脂平板），确保滤膜与培养基紧密接触无气泡。
- 方式二（无菌检查/增菌）：将整个滤膜投入适量的液体培养基中（如硫乙醇酸盐流体培养基），或使用专门的一次性全封闭培养器直接灌注培养基。
- 培养与结果判读：
- 将平板或培养基在规定的温度下（如30-35°C用于细菌，20-25°C用于真菌）倒置培养。
- 菌落计数：培养后，在滤膜表面会长出肉眼可见的菌落，直接计数并报告为CFU/样品体积（如CFU/100mL）。
- 无菌检查：观察液体培养基是否变浑浊，以判断样品中是否有微生物生长。
四、主要应用领域
- 制药行业：
- 无菌检查：对注射液、眼用制剂、生物制品等无菌产品进行强制性安全检查。
- 微生物限度检查：对非无菌药品、纯化水、注射用水进行微生物污染水平监控。
- 医疗器械行业：对注射器💉、导管等产品的无菌检测及微生物负载测定。
- 食品与饮料行业：检测饮料、工艺用水中的总菌落数、大肠菌群等。
- 环境监测：
- 水质分析：检测饮用水、地表水、废水中的总菌落数、大肠杆菌、特定病原菌等。
- 空气微生物监测：通过抽吸空气使其通过滤膜，截留空气中的微生物颗粒，然后进行培养分析。
五、注意事项与局限性
- 高粘度或颗粒物多的样品：容易堵塞滤膜，不适用或需进行特殊前处理（如预过滤、稀释、酶解）。
- 严格的无菌操作：整个过程必须在无菌条件下进行，防止外来污染。
- 方法适用性验证：对于新的样品类型，必须进行验证，以确认所选滤膜、冲洗液和冲洗量能有效去除抑菌性并支持微生物生长。
- 滤膜的选择：需根据目标微生物选择合适的滤膜材质（如混合纤维素酯、聚碳酸酯）和孔径。
总结：膜过滤法是一种强大、通用且可靠的微生物检测技术。它通过富集和分离的核心原理，有效解决了大体积样品检测和抑菌性样品干扰两大难题，是质量控制和无菌保证体系中不可或缺的工具。
