微生物群落的功能解析与资源挖掘长期受限于传统技术对 “个体 - 群体” 关联的解析不足，而微生物单细胞技术的发展为突破这一瓶颈提供了关键支撑。Microbe-seq 凭借高通量优势实现微生物群的单细胞分类与基础特征解析，scRNA-seq 能够精准捕捉单个微生物的转录组动态，反映其功能状态及环境响应机制，FISH-scRACS-seq 则通过系统发育 - 代谢双重导向设计，实现目标类群定位、原位代谢表征与功能基因组解析的闭环。这些技术从不同维度突破了微生物研究中 “不可培养”“功能归属模糊” 等核心难题，为微生物群的精准解析、功能机制阐明及资源挖掘提供了标准化、高分辨率的技术路径，推动微生物研究向更精细、更深入的方向发展。
技术介绍一、微生物单细胞基因组测序技术（Microbe-seq）
技术原理
Microbe-seq 基于微流控技术对单个微生物进行捕获。将捕获有单个微生物的液滴与含有裂解试剂的液体进行合并，让微生物释放出基因组信息后，加入random 6 碱基和 phi29 酶进行多重置换扩增（ MDA ）。之后对扩增得到的基因组进行片段化处理。随后在每个液滴中加入微球，微球上面具有独特的 barcode 标签用来对液滴中的基因组进行标记，之后，打破液滴，对得到的基因组片段进行测序，从而实现高通量（一次 6000 个以上）单细菌的基因组测序。
技术优势
1. 单细胞分辨率，菌株级区分：序列可溯源至单个细胞，能分辨 99.9% 相似性的近缘菌株，解决宏基因组 binning 难题，精准捕获低丰度（0.1%以下）稀有物种。
2. 高通量+低成本：一次实验处理10⁴-10⁵个单细胞，成本低，远超传统单细胞测序通量。
3. 无培养依赖，覆盖广：无需纯培养，可解析99% 不可培养微生物，弥补传统培养法的物种覆盖短板。
4.基因组信息完整：整合同菌株单细胞数据可获得>90% 完整度基因组，同时捕获染色体 + 质粒信息，能揭示水平基因转移等关键机制。
技术应用
1. 人体微生物组：解析肠道/口腔/皮肤菌群的菌株多样性，关联IBD、肥胖、口腔疾病等宿主健康与疾病机制。
2. 环境微生物探索：挖掘深海、热泉等极端环境新物种，筛选污染物降解菌，研究植物根际微生物互作。
3. 微生物生态与进化：观察单细胞水平基因转移，追踪菌株微进化动态，推断菌群内共生/竞争互作网络。
4. 工业生物技术：筛选发酵高产菌株、高效生物能源微生物，挖掘新抗生素合成基因簇。
5. 临床诊断与精准医疗：免培养快速鉴定临床样本病原体，检测耐药基因指导精准用药，设计个性化微生态治疗方案（如益生菌、粪菌移植）。
二、微生物单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）
技术原理
固定微生物细胞以稳定RNA ，通过酶解细胞壁或透化处理使细胞通透，利用随机引物、poly(A)加尾或基因特异性探针捕获mRNA ，经逆转录生成cDNA🧬，再通过组合索引法、液滴微流控或分裂池条形码等混合标记方法进行细胞条形码标记，最后进行高通量测序。
技术优势
1. 捕获单细胞水平表达异质性：突破bulk 测序 “群体平均”的局限，清晰解析菌群内同物种不同细胞、近缘菌株的基因表达差异（如致病菌的毒力基因异质表达、益生菌的代谢基因差异化激活）；
2. 无培养依赖，覆盖广：无需对微生物进行纯培养，可分析 99% 不可培养微生物的转录活性，弥补传统培养法的物种覆盖不足；
3. 高灵敏度，捕获低丰度 /低活性细胞：能检测菌群中低丰度细胞（占比 < 0.1%）、低代谢活性细胞的微弱转录信号，揭示传统技术无法发现的功能亚群；
4. 高通量+ 高性价比：液滴微流控平台一次实验可处理上万级单细胞，单细分析成本低，适合复杂微生物群落的大规模研究，同时可与菌群物种鉴定联合分析，实现“ 物种- 功能”的精准关联。
技术应用
1. 微生物组内分工解析：研究生物膜中代谢异质性、效应分子（如细菌素）产生、胞外基质合成等亚群功能特化，区分物种内“通才型 ”和 “ 专才型 ”亚群的功能分布。
2. 应激反应动力学研究：分析抗生素、化疗药物等胁迫下微生物的异质性耐受机制（如持留菌形成、孢子生成），量化应激诱导的转录多样性。
3. MGE传播与功能研究：追踪噬菌体、质粒等 MGEs 在多物种群落中的宿主分布，解析MGEs对宿主转录组的影响及水平转移的分子机制。
4. 复杂微生物组表征：对肠道、瘤胃、皮肤等微生物组进行高通量单细胞转录组图谱绘制，揭示低丰度物种的功能特征。
5. 跨物种转录组分析：通过与组合索引协议兼容的策略，实现原核与真核微生物（如细菌与真菌）的跨界单细胞转录组分析。
三、荧光原位杂交引导的单细胞拉曼激活分选测序技术（FISH-scRACS-seq）
技术原理
基于宏基因组关联分析（MWAS）筛选的分类学标记设计特异性催化报告分子沉积荧光原位杂交（CARD-FISH）探针，精准定位复杂微生物群中的目标类群（如 γ- 变形菌门）；结合稳定同位素标记（如 D₂O）与单细胞拉曼光谱（SCRS），通过特征性 C-D 拉曼峰（~2157 cm⁻¹）表征目标类群的原位代谢活性（如环己烷降解）；利用拉曼激活重力驱动封装（RAGE）『芯片』，经多激光协同作用分选兼具目标系统发育特征与代谢功能的单细胞，通过多重置换扩增（MDA）技术获得高质量单扩增基因组（SAGs），最终在单细胞分辨率下实现 “类群身份 - 代谢表型 - 功能基因组” 的精准关联，为解析未培养微生物的功能机制、挖掘基因资源提供标准化技术路径。
技术优势
1. 物种-代谢双靶向，精准度跃升：可同时锁定特定分类单元与对应功能活性细胞，彻底解决宏组学技术“功能归属模糊”的问题，物种特异性达100%，有效规避非目标物种对研究结果的干扰，提升研究精准度。
2. 原位代谢无标记，真实反映环境功能：依托拉曼光谱的无标记特性，无需对微生物进行体外纯培养或人工外源标记，直接检测微生物在自然生境中的代谢状态，克服了纯培养技术导致的微生物功能丢失或改变的弊端，更贴合微生物自然生存状态下的功能研究。
3. 单细胞分辨率，实现“身份-功能-基因组”三联关联：所有组学序列均可精准溯源至单个功能细胞，既能解析近缘菌株的代谢异质性（如同一物种中高效降解与低效降解的细胞亚群差异），又能将微生物的物种身份、代谢功能与基因组信息一一对应，构建完整的研究闭环。
4. 高覆盖+低偏好，适配复杂菌群研究：可直接处理土壤、海水等复杂环境样本，对样本中微生物的覆盖率达99.76%，同时能有效捕获细胞的染色体与质粒信息；此外，还可高效挖掘低丰度功能微生物（占比 <0.1% ），突破传统技术对低丰度微生物检测困难的局限。
技术应用
环境微生物功能挖掘：可精准定位并测序海洋、土壤等环境中特定污染物（如环烷烃、石油）的降解菌，挖掘新的代谢基因簇（如三组分 P450系统），为环境生物修复菌株的筛选与应用提供技术支撑，助力环境生物修复与污染治理。
这些技术共同构成了微生物单细胞组学的研究体系，为深入理解微生物的多样性、功能和生态作用提供了强大的工具，推动了微生物学从群体水平向单细胞水平的深入研究。
参考文献
[1]Zheng W, Zhao S, Yin Y, et al. High-throughput, single-microbe genomics with strain resolution, applied to a human gut microbiome. Science. 2022;376(6597):eabm1483.
[2]Pountain AW, Yanai I. Dissecting microbial communities with single-cell transcriptome analysis. Science. 2025;389(6764):eadp6252.
[3]Jing X, Gong Y, Diao Z, et al. Phylogeny-metabolism dual-directed single-cell genomics for dissecting and mining ecosystem function by FISH-scRACS-seq. Innovation (Camb). 2025;6(3):100759.
