细胞外囊泡（EVs）规模化生产，无细胞疗法推动神经修复与免疫治疗应用潜力 #科技 #疗法 #产量 #聚集体 #生物 #生产

细胞外囊泡（EVs）携带着蛋白质和核酸等生物活性成分，能够反映其母细胞的生理状态，并在介导复杂的细胞间信号传递中发挥重要作用。利用这些独特的特性，研究人员已经探索了其在细胞治疗、非侵入性活组织检查和组织再生中的潜在应用。因此，标准化和可扩展的EVs生产与纯化方法对于临床应用和治疗环境很重要。

图为细胞外囊泡（EVs）生成与分泌的途径。来源于文章：Chem Rev. 2018 Jan 31;118(4):1917–1950. doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00534

传统的生产和分离方法产量有限，制约了EVs的潜力。Huang等人近期的综述中介绍了提高EVs生产的策略，主要包括优化细胞产量、扩大培养规模，以及探索非哺乳动物和人工合成囊泡等替代生产来源，还阐述了通过调节培养参数、培养基成分及外部刺激来控制细胞培养，以提升EVs的生产效率。其中生物反应器是 EVs 规模化生产的重要部分，VW垂直轮式生物反应器通过调控 3D 培养、剪切应力（如 20 dyn/cm² 促进 EVs 分泌）、pH 和氧浓度提升产量，且其可扩展性（至 500 L）及模块化控制（如温度、营养供给）使其成为临床转化优选方案。详细内容可参考原文：Huang et al. Emerging technologies towards extracellular vesicles large-scale production. Bioactive Materials 52 (2025) 338–365

以下简要总结了几篇不同来源细胞胞外囊泡（EVs）生物制造研究，这些生物制造的 EVs 展示出功能优势——促进体外和体内模型的恢复。这为神经病学及其他领域的无细胞疗法开辟了令人兴奋的可能性！

1、人类前脑类球体-EVs

对在垂直轮生物反应器中生物制造的人前脑类球体（forebrain spheroids）衍生细胞外囊泡（EVs）进行特征分析

jrhz.info

该研究探索了 Vertical-Wheel 生物反应器（VWBR）中人类前脑类球体来源的细胞外囊泡（EVs）的规模化生产及其特性。通过对比动态培养的iPSC衍生3D聚集体、使用Synthemax II微载体培养及静态聚集体培养3种条件下产生的前脑类球体，发现微载体培养的前脑类球体生长速率更高，其 EVs 产量较静态聚集体提升 240–750 倍，动态聚集体次之。EVs 尺寸在不同培养条件下无明显差异，但微载体和动态聚集体来源的 EVs 富含促进轴突引导、抗凋亡、清除活性氧及调节免疫反应的蛋白质与 miRNA（如 miR-302a、miR-21）。功能实验表明，这些 EVs 可调节氧糖剥夺模型中的细胞代谢，降低凋亡水平，并在体外中风模型中促进神经恢复。研究证实，VWBR 的动态微环境通过调节细胞代谢和 EVs 生物发生基因表达，明显提升 EVs 产量与治疗相关 cargo 含量，为缺血性中风等『神经系统』疾病的 EVs 疗法提供了可规模化的生物制造系统。

图为该篇文章人类诱导多能『干细胞』（iPSC）接种方案示意图、分化时间表和实验设计示意图。

Agg，指在VWBR中培养的聚集体；MC，指在VWBR中附着在Matrigel涂层微载体上的细胞；6-well，指在6孔板中作为静态培养的聚集体。

详细内容参考原文章：Liu et al. Profiling biomanufactured extracellular vesicles of human forebrain spheroids in a Vertical-Wheel Bioreactor. J of Extracellular Bio. 2024;3:e70002.

2、iPSC-EVs

在垂直轮式生物反应器中3D培养人类多能『干细胞』生成细胞外囊泡（EVs）

文中利用新型 Vertical-Wheel 生物反应器（VWBR）规模化生产人诱导多能『干细胞』（hiPSC）分泌的细胞外囊泡（EVs）。研究在 VWBR 中对比了 hiPSC 的三维聚集体与微载体培养模式，并用 mTeSR 和 HBM 培养基培养后收集 EVs。

图为垂直轮生物反应器中诱导多能『干细胞』3D扩增的示意图，含不同培养条件的设置

结果显示，微载体培养的 EVs 产量较聚集体培养高 17-222 倍，且 mTeSR 培养基可使 EVs 产量提升 2.7-3.7 倍，所获 EVs 尺寸更小（约 115.7 nm），富含抗凋亡蛋白及 Wnt 通路相关 miRNA（如 miR-302、miR-21）。同时，结果表明几个EVs生成相关基因受培养条件的影响，而在mTeSR培养基中使用微载体培养可能是对EVs生成刺激较强的条件。功能实验表明，该 EVs 可促进小胶质细胞增殖并诱导其向抗炎 M2 型极化。此研究建立了可靠有效的hiPSC-EVs 生产platform，其低剪切力培养体系适用于规模化生产，EVs 成分在神经保护、『抗衰老』及免疫调节中具潜在价值，为中风、阿尔茨海默病等疾病的细胞外囊泡疗法转化提供了实验基础。详细数据可查看原文章：Muok et al. Extracellular vesicle biogenesis of three-dimensional human pluripotent stem cells in a novel Vertical-Wheel bioreactor. J of Extracellular Bio. 2024;3:e133.

3、hMSC-EVs

在垂直轮式生物反应器中扩大MSCs生产，提高了细胞外囊泡的分泌和cargo谱

这篇2023年的研究探索了新型 Vertical-Wheel 生物反应器（VWBR）规模化培养人间充质基质细胞（hMSCs）对细胞外囊泡（EVs）分泌及成分的影响。在 0.1L 和 0.5L 反应器中，hMSCs 通过微载体培养于 25–64 RPM（0.1–0.3 dyn/cm² 剪切应力），相比 2D 培养，EVs 分泌量提升 2.5 倍，且 EVs 中 miR-10、19a、21、132 等促血管生成和神经保护相关 miRNA 明显上调。蛋白质组学显示，EVs 富含代谢、自噬及 ROS 调控蛋白，与 2D 培养组相比差异明显。0.5L 反应器验证了系统可扩展性，EVs 促进人成纤维细胞伤口愈合能力优于 2D 组。研究表明，VWBR 通过调控 hMSCs 糖酵解、自噬及 ROS 通路，增强 EVs 分泌并重塑其 cargo 谱，为缺血性卒中、阿尔茨海默病等神经疾病的 EVs 疗法提供了可规模化生产的生物制造platform。详细数据可查看原文章：Jeske et al. Upscaling human mesenchymal stromal cell production in a novel vertical-wheel bioreactor enhances extracellular vesicle secretion and cargo profile. Bioactive Materials 25 (2023) 732–747

在上述研究中对富集的EVs终产品的质量要求越严格，也就意味着对培养基的质量要求更加严格，EVs培养基的选择需综合考量EVs产量及下游纯化工艺的复杂性，化学成分限定(Chemically Defined)的培养基是EVs工艺研究中的优选方案。日本Solallis制造的Stem Design系列化学成分限定的MSC扩增培养基(MSC Culture Medium AF)和EVs培养基(EVs Collection Medium)已经在EVs生产工艺中取得成功，且同时兼容2D、3D培养体系。

Stem Design系列培养基具有以下特征：

化学成分限定（Chemically Defined）
无动物源性（Animal Origin Free）
不含细胞外囊泡（EVs Free）
即用型完全培养基，无需额外添加补充剂
成分、浓度准确可控，批次一致性良好
与血清/血清替代物培养体系相当的培养效果

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4、NK 细胞- EVs 的联合抗癌应用

白介素-15刺激的自然杀伤细胞来源细胞外囊泡与卡铂在H1975肺癌细胞中的联合作用

本研究探究了白细胞介素-15（IL-15）刺激的自然杀伤细胞（NK）衍生细胞外囊泡（NK-EVs）与卡铂（CBP）联合用于奥希替尼耐药的 H1975 肺癌细胞的治疗效果。

NK92细胞使用含12.5%马血清、12.5%胎牛血清（FBS）和5%新鲜氢化可的松的MyeloCult H5100培养基培养至第4代。在含5% CO2的培养箱中，每周更换培养基两次。当细胞汇合度达到80-90%时，收获单细胞悬液，并在PBS 0.5L垂直轮生物反应器中培养。接种前一天，细胞在去除外泌体的培养基中培养。反应器中细胞浓度设为20,000个细胞/mL，搅拌速度为25 rpm，采用12个周期交替静态（15分钟）与搅拌（5分钟），总时长为4小时。培养基中加入细胞因子IL-15（25 ng/mL），以增强NK细胞的细胞毒活性。每四天从生物反应器采集0.5 mL培养基，并以25 rpm搅拌，目的是监测NK92细胞的代谢情况并确定培养基的更换时间。使用BioProfile Flex2分析仪评估培养基的乳酸和葡萄糖浓度。根据代谢结果，每四天更换40%的培养基，两周后收集培养基。

通过垂直轮生物反应器培养NK细胞，分离的NK-EVs 经纳米颗粒跟踪分析、原子力显微镜🔬和蛋白质组学表征，显示其具有典型外泌体特征，富含穿孔素、颗粒酶 B 等细胞毒性蛋白。体外实验表明，NK-EVs 与 CBP 联合可降低 CBP 的半数抑制浓度（IC₅₀），明显抑制 2D 和 3D 培养的『肿瘤』细胞活力，诱导细胞周期阻滞和凋亡。体内荷瘤小鼠实验显示，联合治疗明显缩小『肿瘤』体积，机制上通过下调 PD-L1/PD-1 免疫检查点，抑制 SOD2、PARP、BCL2 等抗凋亡蛋白，激活抗炎通路。该研究首次证实 NK-EVs 与 CBP 联合在耐药肺癌中的协同作用，为免疫化疗联合策略提供了新方向。

详细内容和数据可查看原文章：Nathani et al. Combined Role of Interleukin-15 Stimulated Natural Killer Cell-Derived Extracellular Vesicles and Carboplatin in Osimertinib-Resistant H1975 Lung Cancer Cells with EGFR Mutations. Pharmaceutics 2024,16,83.