一、概述
色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术，它已有近百年的发展史。
二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了 GC 技术大发展，而 七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了 HPLC 的迅速发展。
目前除分析化学外，生物化学，石油化学，有机化学，无机化学等学科都普遍采用色谱技术。现代高效液相色谱仪，以其高效，快速和自动化等特点成 为当代分析仪器中发展最快的仪器。HPLC 已成为操作方便、准确、快速并能 解决困难分离问题的强有力的分析手段。
1.1）HPLC 的特点
（1）适用范围广 已知有机物中仅 20%不经预先化学处理，可用 GC 分析；而其余 80%有 机物可用 HPLC 分析。HPLC 适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳 定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。
（2）流动相及固定均与样品分子作用，而 GC 仅固定相与样品分子作用。
（3）具有独特性能的柱填料（固定相）种类较多，具有多种分离方式，适于 各种化合物分析。
（4）分离温度较低，提高了分离效率。
（5）具有一些独特的检测器：电化学，示差折光，可见紫外吸收及荧光检测 器等。
（6）样品易回收。
1.2）HPLC 分类
按分离机理分为四类：
吸附色谱（液固）： 通过试样组分对活性固体表面吸附亲合力的不同实现分离。对具有不同官 能团的化合物和异构体有较高选择性，早期应用较多，现在大多可用正相键合 相色谱替代，常用硅胶柱。
分配色谱： 不同溶质分子按其在固定相和流动相中分配系数不同得到分离。现代分配 色谱即化学键合相色谱，是将各种不同的有机基团通过化学反应键合到硅胶表 面，具有很好的化学稳定性和热稳定性。大部分分离问题都可用键合相色谱解 决。
离子交换色谱： 以离子交换剂为固定相，试样中电离组分与交换剂基体相反电荷的离解部 位亲合力不同而分离。用于分离无机或有机离子。固定相为阴（阳）离子交换 树脂，流动相为电解质溶液。
分子排阻色谱： 按物质分子量大小进行分离。不仅对高聚物，对分子量差别较大的低聚物 或小分子化合物也可进行分离。它又分为用于非水体系的凝胶渗透色谱 （GPC），用于高聚物分子量及其分布的测定。又有适于分离和表征水溶性高 聚物的凝胶过滤色谱。分子排阻色谱主要用于生物化学和高分子化学，在有机 化学中应用也日益增多，已成为 HPLC 的一个重要分支。 上述四种是 HPLC 的重要分支，各有不同分离机理和应用领域，各有独到之处。
气相色谱的基本理论对 HPLC 的发展起了指导和推动作用，并自然延伸到液相色谱。
二、液相色谱仪
HPLC 流程 现代 HPLC 按用途分为分析型、制备型、专用型（GPC），其基本部件相同。 HPLC 仪由输液系统，进样系统，柱系统、检测和记录系统组成。高压泵，色 谱柱和检测器为三大关键部件。
2.1）溶剂贮存器和溶剂脱气
（1） 简单的贮液器为 500ml 试剂瓶，盖严，防溶剂挥发，瓶内泵吸液管端 装 10ul 不锈钢烧结滤头过滤溶剂。溶剂应预先过滤。
（2）流动相脱气
流动相进泵前必须脱气，尤其是水和极性溶剂。否则过柱以后，压力降低 放出溶解的空气。气泡将影响分离效率、基线不稳使检测器灵敏度降低，甚至 不能正常工作。
脱气法：微型真空泵在线脱气，适于单一溶剂（如 GPC）。吹 He 脱气， 如 He 脱气机在线脱气。超声波脱气等。
2.2）输液系统一高压泵
色谱柱用细粒填料，填充紧密，液体流动相粘度高，阻力大，必须高压输 液。泵为关键部件，直接影响整个仪器和分析结果的可靠性。
要求：
- 输出压力高：一般为 150~300kg/cm 2 压力，最高达 500 kg/cm2。
- 流量范围宽：0.1~10ml/min 连续可调
- 流量稳定: 流量恒定无脉冲,流量精度及重现性为+/- 0.5% 左右。
- 耐腐蚀： 耐各种有机溶剂、水和缓冲溶液。
- 密封性好： 泵室小便于清洗维修。
泵分为两类：
恒流泵：柱阻力变化，流动相粘度变化，引起柱压变化而流 量恒定，如往复柱塞泵。
恒压泵：流量可随外界阻力变化而输出压力恒定，如 装柱用的气动泵。
HPLC 广泛采用往复柱塞泵，由液缸，柱塞，单向阀和驱动 机构组成。密封圈耐磨（PTF-石墨）单向阀，柱塞为人造红宝石。
泵流量不稳使保留变化，直接影响峰面积重现性和定量精度，使噪音变大， 最小检测量变大。
双柱塞泵流量平稳，输液精度高，流量精量+/- 0.1% ，流量准确度+/- 1% 。
双柱塞泵液缸容积很小（几微升~几百微升）适于梯度洗脱。
为提供无脉动的准确流量，在输液系统中还需加一些辅助设备：过滤器、 混合器、阻尼器，测压装置。多元混合溶剂 需用比例阀，如二元、三元和四 元比例阀。溶剂按预定比例，低压混合后，经高压泵输入系统。
2.3）进样系统
HPLC 采用六通阀进样，重现性好，操作方便，易于自动化，大大提高了 分析精度。
注射器进样：绝对误差在 5%左右，相对误差在 1%。
阀进样：误差均在 1%以内。进样量由定体积定量管和平头微量注射器控 制，注射器体积应为定量管体积的 2~3 倍。HPLC 柱可注入较大体积的稀溶液， 进样体积在 10~250ul。
2.4）色谱柱
HPLC 发展与柱技术的突破是分不开发。色谱柱是色谱仪的心脏，靠它实现分离。
柱要求：分离效率高，柱容量大，分析速度快。
色谱柱由柱管、凝胶填料、密封环、过滤板等部件组成。色谱柱要耐高压， 耐腐蚀，抗氧化密封不漏液，柱内死体积小。对填料质量和装柱技术有严格要 求。每根柱都附有测试谱图、色谱条件和柱效、对称因子等数据，供用户判断 柱质量。
色谱柱均用指定溶剂充满，防干裂和空气氧化，因而应定期用指定溶剂冲 洗。分析后，不能马上关机，应继续冲洗一段时间，保持柱内清洁。调流速时， 逐渐增减柱压，压力陡然升降，易使柱内形成沟槽损坏。
保护柱：在分析柱入口端加 5~50mm 与分析柱固定相相同的短柱，吸留 过滤流动相及样品中的有害组分，可经常更换，起到保护延长分析柱的作用， 加保护柱虽然柱效有所损失，但在经济和实用方面是有益的。
2.5）HPLC 检测器
连续地将柱中流出组分的含量随时间的变化，转变为易于测量的电信号记 录为样品组分的分离谱图，进行定性定量分析。
在液相状态，流动相和样品的许多物理性质十分接近，找到既通用又灵敏 的检测器是困难的。相对 GC 而言，HPLC 检测器是有待进一步发展的薄弱环 节。对检测器的要求：灵敏度高；对所有组分响应；线性范围宽，响应快；不 易被溶剂腐蚀；死体积小，对流速，温度不敏感；操作方便。
通用型检测器：测定流出物（溶质+溶剂）某种整体参数的变化，如折射 率，电导率，介电常数等。
示差折光检测器（RID）：通过连续测定流出液折光指数变化来测定样品。浓度 ，检测器灵敏度与溶剂和溶质性质都有关系。
响应信号：R=Z Ci ( n I- n o ) z：仪器常数，Ci 溶质摩尔百分数，n I 溶质折射 率，n o 溶剂折射率
响应值与溶质浓度成正比，为浓度型检测器，响应值与溶质与溶剂间折光 指数差( n I- n o )成正比；只要 n I与 n o 有足够差，即可检测，所以为通用检测 器。对没有紫外吸收的物质，如高分子化合物，糖类，脂肪烷烃等都能检测， 是 GPC 必不可少的检测器。
RID 缺点：
- 灵敏度低，为 5 x 10-7 检测限：0.5ug/ml ; 比 UVD 低 2-3 个数量级
- 对流量和温度变化敏感。应严格控制，保持基线稳定，并带自动调零及 自动冲洗检测池装置。为保持流量稳定对泵的流量稳定性有很高要求。
RID带有恒温装置保持恒温，基于以上两点，RID 仅用于常规分析也不能用于梯度洗脱。
选择性检测器：只对某些被测样品或组分响应灵敏，而对流动相响应 甚小。如紫外、荧光和电化学检测器。
紫外（UV）检测器：几乎所有 LC 仪都配备。
用于检测能吸收紫外光的物质，选用工作波长无紫外吸收的溶剂作流动相。
工作原理：适用朗伯-比耳定律 A= ΣCL
A：摩尔消光值 Σ：摩尔吸收系数 C：溶液摩尔浓度 L：光程长
UV 吸收与浓度成正比为浓度型检测器。
可变波长紫外检测器： 按照被测试样品的紫外吸收特性任意选择工作波长，以提高仪器的选择 性。
其优点：
（1） 可以选择样品的最大吸收波长作为检测波长，提高检测灵敏度。
（2） 可以选择样品有强吸收而干扰无吸收的波长处进行分析，提高分析 的选择性。
通常意义的可变波长检测器，就是装有流通池的紫外分光光度计，基结构 见下图。
光源为氘灯，高压氘气被电子激发放电形成连续发射光谱，使用范围在 195nm~400nm 之间，光强度大，稳定性好。从氘灯发出的多色光经过透镜及 滤光片聚焦在单色仪（主要部分为光栅）的入口狭缝上，转动光栅（改变波长） 将选择性地将一窄谱带的光透过出口狭缝。在分束器上分为两个光路，双光路 利用两个光电二极管分别接收来自样品和参比池的光束，以光强差为输出信 号，提高了检测器稳定性。
UVD 特性：
灵敏度较高：10-9 g ；线性范围宽：105 ；选择性强；受流量温度影响小， 稳定性强，操作方便，适于梯度洗脱。
紫外检测器的使用率占各种检测器的 70%左右；对占物质总数约 80%的 有紫外吸收的物质有响应。为使紫外检测器灵敏、稳定，所选溶剂紫外吸收波 长上限应低于测定波长。光电二极管列阵检测器（PDAD）同时进行多波长快 速扫描，得到时间-波长-吸收值三维谱图，对色谱峰的定性和纯度判别很有用 处。
2.5）液相色谱仪柱外效应的影响
在 HPLC 中，样品在液体中扩散系数比气体中小 4~5 个数量级，流速慢 2~3 个数量级。因此，从进样到检测，除柱以外的任何死体积（进样器，柱接 头，连接管，检测器）都导致峰加宽，柱致下降。因此尽量减少柱外死体积影响。
三．溶剂
GC 只是固定相与样品有选择性作用，流动相为惰性载气。 LC 固定相、流动相与样品分子都发生选择性相互作用，流动相在分离中 起重要作用。对于 LC 分析，首先按样品性质选择合适的 LC 类型，当固定相 选定后，分离成功与否就在于流动相选择。
3.1）LC 溶剂的实用要求：
（1）使柱性能稳定
避免使用与固定相发生不可逆吸附的溶剂；柱长期使用，溶剂中杂质在柱 上长期积累，使柱性能变化。HPLC 对溶剂纯度要求很高，可购 HPLC 试剂或 通过蒸馏提纯，除去大部分有紫外吸收的杂质。
（2） 溶剂对样品各组分的溶解能力
HPLC 往往通过改变溶剂组成来改善分离，此时应注意对组分溶解度的影响。
应尽可能用初始流动相溶解样品，以防样品发生沉淀的可能。如流动相不能溶 解样品，溶剂必须与流动相互溶，且注入少量样品。
（3）溶剂与检测器匹配
UVD 所选溶剂的紫外吸收波长上限应低于工作波长，以提高灵敏度，降低 噪音。RID 灵敏度与样品组分与流动相间折光率差值成正比，应选取差值较大 溶剂。
(4) 溶剂沸点、粘度和安全性
沸点低通常粘度低，低沸点、低粘度溶剂一般柱压低传质快，柱效高。一 般低沸点溶剂非常易燃，实验室要有良好通风。
3.2）HPLC 常用溶剂
已烷，二氯甲烷，乙醚，乙腈，甲醇和水，解决 90%HPLC 问题。此外尚 有：异辛烷，CCL4，H CCL3 ，2-氯丙烷，THF，二氧六环，异丙醇，乙酸乙 酯，醋酸。
3.3）溶剂强度和选择性
在 LC 中溶剂与样品分子间作用力有色散力，偶极力，氢键力和介电作用 力。四种力总和越大，二者作用越强。溶质和溶剂分子这四种作用力称为分子 的“极性”。
极性溶剂优先吸引和溶解极性溶质，这就是“相似相溶”原则。溶剂强度 直接与溶剂极性有关。溶剂极性常用极性参数（P 1）表示。
在色谱中，衡量色谱柱对分离组分保留能力的重要参数是 k 值（容量因子 或分配因子）。k=组分在固定相中的量/组分在流动相中的量
在分配色谱中，样品在固定相和流动相中的溶解度决定 k 值。
对于极性溶质在极性强的溶剂中溶解
非极性溶质在极性强的溶剂中溶解度小，k 大，保留长。
在分配和吸附色谱中，溶剂强度通常用混合溶剂来调节。 通过选择溶剂强度可以使样品组分在柱上有合适的保留，一般在 k1~10 之间。
此时分离度大，分离时间不过长，峰扩展不严重，但可能有些组分色谱带 重叠。这就需要改变分离的选择性。其方法是保持溶剂强度不变（k 不变）改 变溶剂组成，不同性质溶剂与溶质间常有不同的特效性相互作用，原来不能分 开的峰可用其它的流动相体系分离。
有时采用三元溶剂体系作流动相，提高色谱分离的选择性，两种强溶剂与 弱溶剂的比例，控制溶剂强度（k）两种强溶剂的相对比例，引起选择性变化。
在 LC，有时仅有几种固定相就解决相当范围的问题，就是靠溶剂在分离中发 挥了重要作用。
四．化学键合相色谱
化学键合相色谱是由液液色谱发起来的。把各种不同有机基团通过化学反 应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，产生了化学键合相色谱。目前， 化学键合相色谱在 HPLC 中占最重要的地位，大部分分离问题都可以用它来解 决。液液分配色谱基本上已不再使用。
4.1）化学键合固定相
硅胶表面的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物以化学键结合方式，覆盖 上一层或数层有机物分子，如非极性 C18，极性带羟基、胺基或氰基的有机分 子。
键合相填料的稳定性很大程度上取决于基体硅胶的稳定性，这与键合硅胶 在碱性（PH>8）和水溶液中的化学溶解相联系。要避免强碱，缓冲溶剂含磷 酸盐、卤化物对键合相稳定性不利。对大多数溶剂 PH=2~8.5 均可使用。使用 温度不超过 60OC 。按键合相和流动相之间相对极性强弱，可将键合相色谱分 为非极性键合相色谱和极性键合相色谱。
4.2）非极性键合相色谱
固定相为非极性键合相，流动相以极性溶剂为主，流动相极性比固定相强， 又称为反相色谱。非极性键合相是在硅胶表面键合上不同链长的正构烷烃或苯基，如 C2，C8，C18，C22 及苯基，使用最多的是十八烷基键合相（简称 ODS 或 C18 ）。烷基链越长对溶质保留越长（k 大），可改善分离选择性。稳定性也好， C18 柱应用最广。反相色谱常用水作流动相，为改善分离效果加入一定量可与 水混溶的“有机改善剂”，如甲醇、乙腈、四氢呋喃、二氧六环苯、以甲醇、 乙腈应用最广。反相色谱适用于分离非极性或极性较弱的化合物，有机调节剂 性质及其与水比例，对色谱保留值和分离选择性有非常重要的影响。
因此，流动相中有机溶剂比例越大，对非极性和弱极性化合物溶解越好。 在柱上保留变小（k 减小）。反之，为加大分辨，应增加水的比例。
非极性键合相，除作常规反相色谱外，还可有许多其它形式的反相色谱技 术。
控制离子化技术：借流动相 PH 的缓冲作用控制溶质的解离度，从而影响 溶质在流动相中溶解度，达到控制保留的目的。适用于弱酸和弱碱分离。
离子抑制技术：在流动相中加入一低浓度的强酸（或强碱），使弱酸或弱 碱处于不电离的形式，以改善分离的峰形。
反相离子对色谱：使用含有离子基的反离子组成中性离子对，用于分离离子型 或可离子化化合物。分离非极性特别强的化合物可用非水反相技术。
正是由于反相技术的“多变性”，使反相色谱的分离对象几乎遍及所有类型的 化合物。
4.3）极性键合相色谱
固定相为极性键合相，流动相以极性小的非极性和弱极性有机溶剂为主溶剂。
固定相极性比流动相强，又称为正相色谱。 极性键合相是硅胶表面键合上极性有机基团，如带-CN，-NH2 ，二醇基 的有机基团。
主要作用力是氢键力。在正相色谱中，流动相为极性小的非极性和弱极性 有机溶剂如烃（已烷、庚烷或异辛烷）或加一定量极性溶剂（氯仿、醇、乙腈 等）调节流动相强度。
正相色谱用于分离油性或水溶性的极性或极性较强的化合物。因此，极性弱组 分分先出峰而极性强组分后出峰。通过改变混合溶剂中极性较强组分的浓度， 对分离选择性起决定性作用。
五．凝胶渗透色谱（GPC）
分子量大的天然和合成高分子，一般不能直接气化，不能用 GC 分析， 因而产生按分子量大小分离的分子排阻色谱（SEC）。
分子（尺寸）排阻色谱 分为：
1．凝胶渗透色谱（GPC）：固定相为疏水凝胶，流动相为有机溶剂，分离油 溶性高聚物。
2．凝胶过滤色谱（GFC）：固定相为亲水凝胶，流动相为水溶液，分离生物 高分子如蛋白质、核酸、酶及多糖。
GPC 以制备时严格控制孔径的多孔凝胶作固定相，GPC 使用最多的是交 联聚苯乙烯凝胶，凝胶中最大孔径到最小孔径间的分布连续均匀。
凝胶的孔径及其分布与被测试样分子尺寸相适应，完全不能进入填料凝胶 孔径内的大分子，只能在填料颗粒间空隙中通过，最早流出（即全部排阻）； 能自由出入填表料孔内小分子，最后流出（即全部渗透）；其它分子在填料孔 内停留时间不同而按分子的大小顺序分离。适用的溶质分子量范围为 100~5x108 ,每支柱都有其分子量排阻极限。因此，在 GPC 测定中，可采取多 柱串联。
GPC 使用单一溶剂，实验条件温和重现性好，分析速度快，溶质回收率 高。
目前，HP-GCP 应用远远超出了高聚物分子量及其分布的测定范围，它在 小分子混合物分离提纯，组成测定等方面发挥了很大作用。它简便快速分离、 测定组分中分子量相差较大的简单化合物，一般分子量相差>10%的组分能得 到较好的分离。
GPC 是 LC 的一种，现代 HPLC 分析仪只要改变填料种类（配合 GPC 软 件）就可用于 GPC 分析。
六 色谱分离条件的选择
选择分离条件的目的是在尽可能短的时间内，按照分辨率的要求，将混合物中各组分分开。
6.1）选择最佳柱系统，达到最佳柱效，使分离组分在柱内有合适保留。
增加柱效有两种途径：一是增加柱长，可改善分离，但随之柱压增高，分析时间增加。在满足分离度的情况下，尽量用短柱，快速分离。一般柱长为 10~30cm。
二是减小填料粒径，改变传质增加柱效，但柱压增高，可用短柱。 合适的保留值：双组分 2≤k≤5，多组分混合物 0.5≤k≤20 。
6.2）使选择性最佳化
柱选定后,优化流动相的组成,使混合物各组分间呈现最大的分离因子。
常用 HPLC 柱，柱效一万理论塔板数左右，对一般 10～20 组分分离，足以提 供柱内峰的位置，关键是合理调节谱带在柱中分布位置，使各组分间达到好的 分离。
定量描述柱选择性的参数是分离因子 （α）值，在 HPLC 分析中，通过 优化流动相组成，改变难分离物质对的分离因子。调节α即增加溶剂选择性最 常用的方法，就是调节混合溶剂中强溶剂的类型，使溶剂与溶质间呈现 不同 的特效性相互作用，使难分离物质对分开。
在初步分离中：
1． 如果 k 太小 （<1），增加弱溶剂量，使 k 增大（使 1≤k≤10 最佳值）。
2． 如果 k 太大 ，增加强溶剂量，使 k 减小（使 1≤k≤10 最佳值） 因此，选择性优化 的关键是流动相的选择，改变溶剂强度，控制 k 值， 改变流动相组成控制α值。
七 定性定量分析
色谱法的优势是使混合物得到分离\测定，分离是基础定量是目的。
色谱法的长处在于定量准确，而定性是其薄弱环节。对已知物成分分析， 组成已知，其出峰位置可用标准样保留值定性。而对未知物分析，色谱法显得 很弱，如 GC 多柱定性，LC 二极管列阵检测器快速全波段扫描，其 UV 吸收 曲线对组分定性很有帮助，但是还要与红外 （IR），质谱 （MS ）联用，以 IR，MS 作为色谱检测器定性。
HPLC 引用 GC 定量方面的成就，其定量准确度高，定量范围宽，完全比 得上，甚至优于 GC。HPLC 样品制备简单，用反相柱可直接进水样。HPLC 既可用于简单样品主要组分的高精度分析，也可用于复杂样品的微量或痕量分析。
